| 公開(公告)號(hào) | CN1560253A |
| 公開(公告)日 | 2005.01.05 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200410007534.3 |
| 申請(qǐng)日期 | 2004.02.25 |
| 專利名稱 | 多拷貝串聯(lián)肽抗生素hPAB的制備 |
| 主分類號(hào) | C12N15/31 |
| 分類號(hào) | C12N15/31;C12N1/21;C12P21/00;A61P31/04 |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 胡福泉;饒賢才;黎庶;胡金川 |
| 地址 | 400038重慶市沙坪壩區(qū)高灘巖正街30號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | |
| 代理人 | |
| 國(guó)省代碼 | 重慶;85 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 多拷貝串聯(lián)肽抗生素hPAB的制備，其特征是：首先根據(jù)肽抗生素hPAB氨基酸序列對(duì)應(yīng)的核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物：上游引物P1：下游引物P2：然后通過(guò)PCR技術(shù)在hPAB基因的5’端依次加上核酸內(nèi)切酶BamHI、AvaIII，天冬酰胺對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，在hPAB基因的3’端依次加上甘氨酸對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，核酸內(nèi)切酶PstI，終止密碼子TAA和核酸內(nèi)切酶HindIII。PCR產(chǎn)物回收后用BamHI和HindIII酶切，用T4DNA連接酶將之連接到pQE-32表達(dá)質(zhì)粒的BamHI/HindIII位點(diǎn)上，采用酶切、核苷酸測(cè)序篩選陽(yáng)性重組子。提取陽(yáng)性重組子質(zhì)粒，分為兩份，一份用XhoI+AvaIII雙酶切后回收大片段(含單拷貝hPAB)，另一份用XhoI+PstI雙酶切后回收小片段(含單拷貝hPAB)，將大、小片段用T4連接酶連接后即可得含雙拷貝hPAB的重組質(zhì)粒pQE-hPAB-2；若再將pQE-hPAB-2質(zhì)粒分兩份，一份用XhoI+AvaIII雙酶切后回收大片段(含雙拷貝hPAB)，另一份用XhoI+PstI雙酶切后回收小片段(含雙拷貝hPAB)，將大、小片段用T4連接酶連接后即可得含四拷貝hPAB的重組質(zhì)粒pQE-hPAB-4；若將上述雙酶切后含雙拷貝hPAB的大片段與含單拷貝hPAB的小片段連接即可獲得含三拷貝hPAB的重組質(zhì)粒pQE-hPAB-3；如此重復(fù)，分別構(gòu)建含1～8拷貝hPAB重組體的工程菌，進(jìn)行表達(dá)。上述克隆的技術(shù)路線如下：BamHIAvaIIIAsnhPABGlyPstIStopcodonHindIIIGGATCCGATGCAAAC＝GGCCTGCATTAAAAGCTT |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種多拷貝串聯(lián)肽抗生素hPAB的制備方法。通過(guò)分子生物學(xué)操作，將hPAB構(gòu)建成多拷貝體，并由表達(dá)載體介導(dǎo)在大腸桿菌中高效表達(dá)，多拷貝體表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的15～25％。以三拷貝工程菌為例，表達(dá)量為20％，純化的一個(gè)三拷貝體分子經(jīng)裂解可獲得3個(gè)活性單體，制備效率增加了200％。本發(fā)明公開的制備方法具有分離純化方法簡(jiǎn)單，成本低，易于放大，產(chǎn)物純度高、殺菌力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品保鮮及護(hù)膚品等領(lǐng)域。 |
| 國(guó)際公布 |
