| 公開(公告)號(hào) | CN1203093C |
| 公開(公告)日 | 2005.05.25 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN03115855.2 |
| 申請(qǐng)日期 | 2003.03.12 |
| 專利名稱 | 含乳鐵蛋白全蠶粉的生產(chǎn)方法 |
| 主分類號(hào) | C07K14/79 |
| 分類號(hào) | C07K14/79;C12P21/00;C12N15/09;C12N15/79;C12N15/866;C12N15/12 |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 浙江大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 汪以真;許梓榮;黃海青 |
| 地址 | 310027 浙江省杭州市西湖區(qū)玉古路20號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 |
| 代理人 | 韓介梅 |
| 國省代碼 | 浙江;33 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 含乳鐵蛋白全蠶粉的生產(chǎn)方法，其特征是包括以下步驟：1)取泌乳1-21天母畜乳腺腺泡，液氮冷凍研磨成粉末，提取總RNA并通過反轉(zhuǎn)錄得到LF-cDNA，根據(jù)乳鐵蛋白基因特征設(shè)計(jì)一對(duì)各帶一個(gè)酶切位點(diǎn)的引物，利用RT-PCR技術(shù)得到DNA，PCR產(chǎn)物割膠純化后，用引物中對(duì)應(yīng)的兩個(gè)內(nèi)切酶雙酶切，定向連接入以上兩個(gè)酶切過的pGEM-3Z載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG-1，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，再接種3ml液體LB培養(yǎng)基，37℃搖床200rpm振蕩培養(yǎng)至少8小時(shí)；2)將以上培養(yǎng)的TG-1抽提質(zhì)粒，對(duì)應(yīng)雙酶切，割膠回收目的片段，定向克隆進(jìn)轉(zhuǎn)移載體pVL1393，得到重組轉(zhuǎn)移載體pVL1393-LF，同時(shí)用Bsu36I酶切野生型桿狀病毒DNA，在透明的聚苯乙烯滅菌管中加入下列試劑：pVL139315.0μl，野生型桿狀病毒DNA1.0μL，滅菌水10.0μL，lipofectin14.0μL輕輕混勻，常溫下放置15分鐘，在此期間待轉(zhuǎn)染的家蠶細(xì)胞吸去培養(yǎng)基，用無血清TC-100培養(yǎng)基洗三次，最后加入2mL無血清TC-100培養(yǎng)基，15分鐘以后，用移液器吸取上述40.0μL共轉(zhuǎn)染試劑，分三處滴入細(xì)胞中，輕輕搖勻，然后用parafilm密封，27℃培養(yǎng)5天；3)待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，將母液按10-3、10-4、10-5的濃度梯度進(jìn)行稀釋，吸取1μL的病毒稀釋液接種到貼壁細(xì)胞中，搖動(dòng)使之均勻，27℃感染1小時(shí)后，移去接種液，在病毒接種時(shí)將3％低熔點(diǎn)瓊脂糖熔化，保溫在40℃水浴中，然后與等體積預(yù)熱到40℃的含20％胎牛血清的2XTC-100快速混合均勻，將此混合液輕輕加到已移走接種液的貼壁細(xì)胞上，等膠凝固后封口，逐日觀察病毒斑生長情況，當(dāng)病毒斑明顯后，在顯微鏡下挑取分隔良好的12個(gè)病毒斑，接種于5×104細(xì)胞密度且已貼壁生長的24孔板中，至細(xì)胞呈感染態(tài)時(shí)，收集病毒液，向殘余的細(xì)胞中添加100μgX-gal的溶液，37℃溫育1小時(shí)后，選取白斑按上述步驟進(jìn)一步篩選，重復(fù)篩選至獲得重組病毒HyBacPAK-LF；4)將純化的重組病毒每頭約106pfu注射5齡起蠶，喂給新鮮桑葉，飼養(yǎng)五天后于冰上收集蠶血，加入0.1％蠶血體積的苯基硫脲，10000rpm離心10分鐘，取上清，再注射5齡起蠶，106pfu/頭，喂給新鮮桑葉，飼養(yǎng)5天，待家蠶發(fā)病后，收集病蠶冷凍干燥，粉碎，即得含乳鐵蛋白的全蠶粉。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了含乳鐵蛋白全蠶粉的生產(chǎn)方法，它是以桿狀病毒為載體，用家蠶為生物反應(yīng)器生產(chǎn)含乳鐵蛋白全蠶粉的。應(yīng)用本發(fā)明方法生產(chǎn)含乳鐵蛋白全蠶粉，產(chǎn)率高，在生產(chǎn)和使用過程中對(duì)人畜安全無毒，適宜大批量生產(chǎn)和使用。以此方法生產(chǎn)的含乳鐵蛋白全蠶粉因含有殺菌抗病毒的乳鐵蛋白，故作為飼料添加劑在補(bǔ)充飼料蛋白的同時(shí)可起到抗病防病的作用，而且動(dòng)物不會(huì)產(chǎn)生抗藥性，可部分或全部替代飼料中的抗生素。 |
| 國際公布 |
