| 公開(公告)號 | CN1683541A |
| 公開(公告)日 | 2005.10.19 |
| 申請(專利)號 | CN200510033569.9 |
| 申請日期 | 2005.03.17 |
| 專利名稱 | 人神經營養(yǎng)素-3受體基因重組腺病毒構建方法 |
| 主分類號 | C12N15/861 |
| 分類號 | C12N15/861;C12N15/12;C12Q1/68 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權 | |
| 申請(專利權)人 | 中山大學中山醫(yī)學院科技開發(fā)中心 |
| 發(fā)明(設計)人 | 曾園山;王俊梅 |
| 地址 | 510089廣東省廣州市中山二路74號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構 | |
| 代理人 | |
| 國省代碼 | 廣東;44 |
| 主權項 | 一種人神經營養(yǎng)素-3受體基因重組腺病毒構建方法，其特征是，該方法包括(1)引物設計合成：從GenBank檢索人TrkC基因，針對基因全長設計兩端引物；(2)RT-PCR過程：取人腦mRNA進行反轉錄，反應結束后，取反應液5ml于1％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察結果；(3)克隆穿梭載體pShuttle-TrkC的構建及鑒定：取RT-PCR反應液，0.8％瓊脂糖凝膠電泳后，割膠純化目的基因(TrkC)片斷；連接純化TrkC基因和線性化的pShuttle，將產物擴增并提取質粒，再測序鑒定質粒中目的基因的序列；(4)重組腺病毒載體pAdeno-TrkC的構建及鑒定：將pShuttle-TrkC與腺病毒骨架質粒連接，常規(guī)方法轉化后進行擴增并提取質粒，并測序鑒定；(5)293細胞包裝：pAdeno-TrkC用脂質體介導轉染HEK293細胞，轉染后第10天出現293細胞病變；收集病變細胞于-80℃/37℃反復凍融3次獲得病毒粗裂解液，并反復感染293細胞擴增病毒；(6)重組腺病毒的鑒定：①PCR鑒定：抽提病毒DNA為模板，以目的基因的上、下游引物進行PCR鑒定；②RT-PCR鑒定：Ad-TrkC感染293細胞后收獲細胞，用Trizol試劑提取總RNA進行反轉錄；反應結束后，取反應液5ml于1％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察結果；③免疫細胞化學染色：將上述粗裂解的病毒液感染體外培養(yǎng)的神經干細胞球，用免疫細胞化學染色證實是否Ad-TrkC轉染；④Westernblot：粗裂解的Ad-TrkC病毒液感染神經干細胞24小時后，裂解細胞做Westernblot證實是否有TrkC表達；(7)人神經營養(yǎng)素-3受體基因重組腺病毒表達載體的生物學活性檢測：體外培養(yǎng)取自于綠色熒光小鼠海馬的神經干細胞，觀察神經營養(yǎng)素-3和神經營養(yǎng)素-3受體對體外培養(yǎng)的神經干細胞誘導分化的影響。 |
| 摘要 | 本發(fā)明涉及一種用人神經營養(yǎng)素-3受體基因(人TrkC基因)重組的腺病毒表達載體的構建方法及其應用。本發(fā)明的基本方案包括：引物設計合成，RT-PCR過程，克隆穿梭載體pShuttle-TrkC的構建及鑒定，重組腺病毒載體pAdeno-TrkC的構建及鑒定，293細胞包裝，重組腺病毒的鑒定，人神經營養(yǎng)素-3受體基因重組腺病毒表達載體的生物學活性檢測等步驟。本發(fā)明的優(yōu)點在于選擇一種基因重組腺病毒表達載體來促進受損傷的中樞神經元存活及其軸突再生，以及促進神經干細胞更多地分化為神經元，替換受損傷的神經元或死亡的神經元。 |
| 國際公布 |
