公開(公告)號(hào)
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CN1793324A
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公開(公告)日
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2006.06.28
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申請(qǐng)(專利)號(hào)
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CN200510045207.1
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申請(qǐng)日期
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2005.11.25
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專利名稱
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利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)及糖基化改造人干擾素-β的方法
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主分類號(hào)
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C12N1/19(2006.01)I
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分類號(hào)
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C12N1/19(2006.01)I;C12N15/22(2006.01)I;C12P21/02(2006.01)I;C12R1/84(2006.01)N
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分案原申請(qǐng)?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(qǐng)(專利權(quán))人
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山東大學(xué)
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發(fā)明(設(shè)計(jì))人
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陳 敏;王慶杰;王 鵬
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地址
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250100山東省濟(jì)南市歷城區(qū)山大南路27號(hào)
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頒證日
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國(guó)際申請(qǐng)
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進(jìn)入國(guó)家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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濟(jì)南金迪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
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代理人
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鮑光明
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國(guó)省代碼
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山東;37
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主權(quán)項(xiàng)
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一種利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)及糖基化改造人干擾素-β的方法,由下述步驟組成 (1)重組表達(dá)載體的構(gòu)建: 克隆出人IFNβ基因,通過PCR方法將IFNβ基因起始密碼子ATG前增加KR=AAAAGA序列,以提高Kex2蛋白酶的酶切作用,避免畢赤酵母分泌表達(dá)外源基因時(shí)存在信號(hào)肽切割不完全,使重組蛋白N端帶有信號(hào)肽氨基酸序列的情況;同時(shí)末端Arg的堿基CGA設(shè)計(jì)為畢赤酵母喜好密碼子AGA,以提高IFNβ在畢赤酵母中的表達(dá);完成分子水平基因改造后將基因構(gòu)建到酵母表達(dá)載體中,得重組表達(dá)載體; (2)重組酵母菌株的構(gòu)建: 用SalI將重組載體pPIC9kIFNβ線性化;電轉(zhuǎn)到酵母菌株基因組中,構(gòu)建重組酵母菌株;在MD平板上長(zhǎng)出的菌落為陽(yáng)性克隆;其中,MD平板培養(yǎng)基配方為:13.4g/L酵母基本氮源;0.4mg/L生物素;20g/L葡萄糖;通過G418抗生素篩選出高拷貝的陽(yáng)性菌株; (3)人干擾素-β蛋白在酵母中誘導(dǎo)表達(dá): 將上述陽(yáng)性菌株,接種于YPD培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)12-24小時(shí),搖床轉(zhuǎn)速為240-270轉(zhuǎn)/分;當(dāng)發(fā)酵液濃度達(dá)OD=5-6時(shí),按體積比1∶100的接種量轉(zhuǎn)接到BMG培養(yǎng)基中培養(yǎng),溫度30℃,搖床轉(zhuǎn)速為240-270轉(zhuǎn)/分,培養(yǎng)28~35小時(shí);5000g離心5~10分鐘,收集菌體,用PBS洗滌菌體1~2次,轉(zhuǎn)接到BMM液體培養(yǎng)基中,使發(fā)酵液濃度達(dá)OD=0.5-1.0時(shí),誘導(dǎo)培養(yǎng),誘導(dǎo)溫度20℃-30℃,搖床轉(zhuǎn)速為180-250轉(zhuǎn)/分,每隔12小時(shí)向培養(yǎng)基中加入5~10ml/L量的甲醇,培養(yǎng)24-96小時(shí); 其中PBS為:pH6.0,100mM磷酸鹽緩沖液; 其中YPD培養(yǎng)基配方為:10g/L酵母粉;20g/L蛋白胨;20g/L葡萄糖; 其中BMG培養(yǎng)基配方為:pH6.0,100mM磷酸鹽緩沖液,酵母基本氮源13.4g/L,生物素0.4mg/L,甘油10mL/L; 其中BMM液體培養(yǎng)基配方為:pH6.0,100mM磷酸鹽緩沖液,酵母基本氮源13.4g/L,生物素0.4mg/L,甲醇5mL/L; 其中,上述重組陽(yáng)性克隆工程菌株可以通過離心、過濾去除; (4)重組蛋白提取及純化 選用藍(lán)譜直接將酵母菌株的上清液進(jìn)行重組蛋白的純化; (5)對(duì)重組蛋白進(jìn)行表面糖鏈的改造 選用外切糖苷酶對(duì)所得重組蛋白進(jìn)行糖基化改造;在一定的酶反應(yīng)條件下切除重組干擾素β蛋白的糖鏈部分。
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摘要
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本發(fā)明公開了一種利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)及糖基化改造人干擾素-β的方法。本發(fā)明應(yīng)用重組DNA技術(shù)在甲醇酵母細(xì)胞如巴斯德畢赤酵母細(xì)胞中生產(chǎn)基因重組人干擾素β并進(jìn)行糖基化改造的方法,獲得既具有真核生物的蛋白翻譯后修飾和加工,又不具有抗原性的干擾素β蛋白。本發(fā)明還涉及適合甲醇酵母表達(dá)的人干擾素β改構(gòu)基因的設(shè)計(jì);表達(dá)載體的構(gòu)建;基因組中至少穩(wěn)定地整合有一個(gè)拷貝改構(gòu)干擾素β基因的甲醇酵母工程菌;工程菌的基因表達(dá);糖基化改造等方面。本發(fā)明方法可實(shí)現(xiàn)干擾素β高效表達(dá)及糖鏈改造,且分離工藝簡(jiǎn)便。所產(chǎn)生的干擾素β不具有酵母蛋白的N-糖基化,若作為蛋白藥物不會(huì)在人體內(nèi)產(chǎn)生免疫源性;也不會(huì)因?yàn)檫^糖基化使表達(dá)蛋白失去活性。
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國(guó)際公布
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