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與人乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的分離和分離方法

公開(公告)號(hào) CN1810979A  
公開(公告)日 2006.08.02  
申請(qǐng)(專利)號(hào) CN200510013150.7  
申請(qǐng)日期 2005.01.28  
專利名稱 與人乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的分離和分離方法  
主分類號(hào) C12P19/34(2006.01)I  
分類號(hào) C12P19/34(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I;C12N5/06(2006.01)I;C07H21/04(2006.01)I  
分案原申請(qǐng)?zhí)?  
優(yōu)先權(quán)  
申請(qǐng)(專利權(quán))人 南開大學(xué)  
發(fā)明(設(shè)計(jì))人 葉麗虹;張曉東;尤嘉琮;王長(zhǎng)曄  
地址 300071天津市衛(wèi)津路94號(hào)  
頒證日  
國(guó)際申請(qǐng)  
進(jìn)入國(guó)家日期  
專利代理機(jī)構(gòu) 天津市學(xué)苑有限責(zé)任專利代理事務(wù)所  
代理人 鄭 楠  
國(guó)省代碼 天津;12  
主權(quán)項(xiàng) 一種與人乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的分離方法,其特征在于包括: 1)用SCID(Severecombinedimmunodeficiency,SCID)從人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中篩選和建立具有高轉(zhuǎn)移傾向的轉(zhuǎn)移亞克隆LM-MCF-7細(xì)胞系; 2)細(xì)胞培養(yǎng) 將LM-MCF-7和MCF-7細(xì)胞用RPMI1640(含有10%FBS、100u/ml硫酸鏈霉素和100u/ml青霉素)培養(yǎng)液,在37℃、5%CO2條件下CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng); 3)總RNA提取 一步法提取MCF-7和LM-MCF-7細(xì)胞的總RNA,用異丙醇沉淀,并過柱純化; 4)cDNA反轉(zhuǎn)錄及熒光標(biāo)記 取一定量總RNA,以T7-Oligo(dT)15為引物,合成雙鏈cDNA,純化;之后將雙鏈cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA、純化;取cRNA,用SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶(200u/μl),9個(gè)堿基的隨機(jī)序列寡核苷酸引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA并純化;取cDNA,用9個(gè)堿基的隨機(jī)序列寡核苷酸引物和KLENOW酶進(jìn)行熒光標(biāo)記,之后純化并抽干;標(biāo)記過程中dATP,dGTP,dTTP使用濃度為120μM,dCTP為60μM,Cy5-dCTP,Cy3-dCTP為40μM,dNTP為10mM; 5)制備人寡聚核苷酸標(biāo)準(zhǔn)基因芯片 將Qiagen公司人類基因的Oligo庫(kù)中的寡聚DNA點(diǎn)制在一張75×25mm、經(jīng)過化學(xué)修飾的載玻片上;點(diǎn)制在芯片上的樣品還包括人的12個(gè)看家基因作為陽(yáng)性對(duì)照,12條人工合成的與人基因沒有同源性的70個(gè)堿基的寡聚DNA作為陰性對(duì)照,以及擬南芥的3個(gè)基因作為外標(biāo);整個(gè)點(diǎn)陣分成48個(gè)亞陣;每個(gè)亞陣有22行,22列;點(diǎn)間距為185μm,點(diǎn)的直徑約為140μm; 6)雜交與洗滌 將標(biāo)記的DNA溶于35μl雜交液中,放入標(biāo)準(zhǔn)基因芯片于42℃雜交過夜;雜交結(jié)束后,將芯片在42℃含有0.2%SDS和2×SSC的液體中洗5分鐘,再在0.2×SSC中室溫洗5分鐘,最后甩干用于掃描; 雜交液的組分為:3×SSC,0.2%SDS,5×Denhart’s,25%甲酰胺; 7)篩選確定 用ScanArrayExpress雙通道激光掃描儀掃描基因芯片,用GenePixPro4.0軟件分析芯片上每個(gè)點(diǎn)Cy3和Cy5熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值,并用Lowess方法歸一化;以差異為兩倍(即比值大于2.0,小于0.5)的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定差異表達(dá)基因。  
摘要 本發(fā)明公開了一種高精確度、高通量篩選篩選乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的分離方法。本發(fā)明方法通過建立具有高轉(zhuǎn)移傾向的轉(zhuǎn)移亞克隆LM-MCF-7細(xì)胞系與其親本人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7形成配對(duì)細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)樣本,不僅可隨時(shí)無(wú)限量培養(yǎng)獲得,且由于實(shí)驗(yàn)樣本的細(xì)胞成分均一,保證了分離結(jié)果的精確性和準(zhǔn)確性。本發(fā)明方法還通過基因表達(dá)譜芯片技術(shù)分離出了與人乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因,這些相關(guān)基因的表達(dá)和功能的確認(rèn),在乳腺癌藥物或基因治療方面以及在用于制備腫瘤轉(zhuǎn)移芯片、制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移基因疫苗及建立抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物篩選技術(shù)平臺(tái)方面,都將有著重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。  
國(guó)際公布  
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