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利用乳腺生物反應(yīng)器制備重組人的抗凝血酶Ⅲ蛋白的方法

公開(公告)號(hào) CN1944645A  
公開(公告)日 2007.04.11  
申請(專利)號(hào) CN200610102042.1  
申請日期 2006.10.17  
專利名稱 利用乳腺生物反應(yīng)器制備重組人的抗凝血酶Ⅲ蛋白的方法  
主分類號(hào) C12N15/09(2006.01)I  
分類號(hào) C12N15/09(2006.01)I;C12N15/85(2006.01)I;C12N15/12(2006.01)I;C12N5/06(2006.01)I;C12N15/06(2006.01)I;A61K38/17(2006.01)I  
分案原申請?zhí)?  
優(yōu)先權(quán)  
申請(專利權(quán))人 青島森淼生物技術(shù)研究所  
發(fā)明(設(shè)計(jì))人 袁三平;鄒賢剛;鮮 建  
地址 255068山東省青島市株州路177號(hào)惠特工業(yè)園A區(qū)5號(hào)樓2層  
頒證日  
國際申請  
進(jìn)入國家日期  
專利代理機(jī)構(gòu) 青島發(fā)思特專利商標(biāo)代理有限公司  
代理人 蔡紹強(qiáng)  
國省代碼 山東;37  
主權(quán)項(xiàng) 一種利用乳腺生物反應(yīng)器制備重組人的抗凝血酶III蛋白的方法,其特征是該方法包括下述步驟: (1)選用哺乳動(dòng)物的乳蛋白基因?yàn)檗D(zhuǎn)基因的調(diào)控區(qū)和表達(dá)框架,在乳蛋白基因的表達(dá)框架上建立唯一的酶切位點(diǎn)和乳蛋白分泌序列,然后將重組人的抗凝血酶III蛋白基因和腸激酶蛋白質(zhì)酶切序列連接在乳蛋白基因的表達(dá)框架上,轉(zhuǎn)基因載體的末端再連接一個(gè)篩選基因; (2)所構(gòu)建的載體經(jīng)DNA序列分析,確定人的抗凝血酶III蛋白基因與乳蛋白基因的DNA序列,并與乳蛋白基因本身的表達(dá)和功能基因的基酸組成一致; (3)用電穿孔或脂質(zhì)體誘導(dǎo)的方法,將人的抗凝血酶III蛋白基因表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的動(dòng)物的體細(xì)胞中; (4)在培養(yǎng)基中對細(xì)胞株進(jìn)行篩選,獲得篩選后的陽性細(xì)胞株;一部分細(xì)胞冷凍保存,一部分細(xì)胞用于制備DNA; (5)陽性細(xì)胞株的DNA,經(jīng)PCR和Southern雜交分析,確定含有人的抗凝血酶III蛋白基因的細(xì)胞株; (6)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞株的細(xì)胞移入山羊成熟的去核卵母細(xì)胞的卵周隙內(nèi),然后使供核細(xì)胞和去核卵母細(xì)胞融合; (7)將克隆胚胎移植到寄母羊的輸卵管中,經(jīng)妊娠獲得轉(zhuǎn)基因克隆羊; (8)檢測轉(zhuǎn)人的抗凝血酶III蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳汁中的重組人的抗凝血酶III蛋白含量; (9)含有人的抗凝血酶III蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳汁中的重組人的抗凝血酶III蛋白的提純; (10)純化的重組人的抗凝血酶III蛋白的動(dòng)物試驗(yàn); (11)重組人的抗凝血酶III蛋白在人體上的應(yīng)用。  
摘要 本發(fā)明涉及一種利用乳腺生物反應(yīng)器制備重組人的抗凝血酶III蛋白的方法。其包括:選哺乳動(dòng)物的乳蛋白基因?yàn)檗D(zhuǎn)基因的調(diào)控區(qū)和表達(dá)框架,在框架上建立一個(gè)唯一的酶切位點(diǎn),再將人AT-III蛋白基因功能部分,乳蛋白分泌序列和腸激酶蛋白質(zhì)酶切序列基因,連接在表達(dá)框架上,載體的末端再連接一個(gè)篩選基因;將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的動(dòng)物體細(xì)胞中;獲得含有人的AT-III蛋白基因的細(xì)胞株;轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株移入山羊成熟的去核卵母細(xì)胞內(nèi),使供核細(xì)胞和去核卵母細(xì)胞融合;克隆胚胎移植到寄母羊的輸卵管中,經(jīng)妊娠獲得轉(zhuǎn)基因克隆羊;檢測轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁中的人AT-III蛋白的含量和活性、提純;經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)和人體試驗(yàn);重組人AT-III蛋白在人體上的應(yīng)用。  
國際公布  
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