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1.5 雙歧桿菌特異性引物及細(xì)菌通用引物的設(shè)計(jì)根據(jù)Genebank上雙歧桿菌的16S rRNA基因序列[3]、參考文獻(xiàn)重復(fù)率較高的引物及引物合成公司(大連寶生物工程有限公司)的建議設(shè)計(jì)本試驗(yàn)所用引物的基因序列，分別設(shè)計(jì)了細(xì)菌的通用引物、雙歧桿菌屬特異性引物[8]和齒雙歧桿菌特異性引物[9]。本試驗(yàn)引物序列及預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度見(jiàn)表1。
1.6 細(xì)菌DNA的提取及PCR反應(yīng)
將備用的細(xì)菌離心，收集沉淀，按照細(xì)菌DNA提取試劑盒的要求提取總DNA，-70 ℃保存。PCR反應(yīng)體系的總體積為25 μL，其中Tag酶12.5 μL，10 μm·L-1上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，去離子水9.5 μL�；靹蚝箅x心5 s。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，然后95 ℃變性30 s，56.7 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃最終延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%瓊脂糖凝膠和Tris硼酸鹽乙二胺四乙酸(Tris/borate/ethylenediaminotetraacetic acid，TBE)緩沖液中電泳30 min，電壓220 V。采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄電泳條帶。
1.7 統(tǒng)計(jì)分析
用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)S-ECC組和無(wú)齲組兒童菌斑中雙歧桿菌的檢出率進(jìn)行2個(gè)率比較的卡方檢驗(yàn)分析，對(duì)S-ECC組兒童不同部位的雙歧桿菌檢出率進(jìn)行行乘列表的卡方檢驗(yàn)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。
2 結(jié)果
經(jīng)細(xì)菌的分離培養(yǎng)、生化鑒定及PCR鑒定，2組兒童的雙歧桿菌檢出率見(jiàn)表2，同一兒童不同部位的雙歧桿菌和齒雙歧桿菌的檢出率見(jiàn)表3。由表2可見(jiàn)，40例S-ECC組兒童中有19例檢出雙歧桿菌，30例無(wú)齲組兒童均未檢出雙歧桿菌(表2)，2組檢出率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由表3可見(jiàn)，兒童口腔不同部位的雙歧桿菌檢出率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，齒雙歧桿菌在不同部位檢出率的差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)PCR產(chǎn)物電泳圖進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：所有樣本均有細(xì)菌通用引物的PCR產(chǎn)物表達(dá);檢出雙歧桿菌的樣本既有細(xì)菌通用引物的表達(dá)，又有雙歧桿菌通用引物的表達(dá)(圖1);檢出齒雙歧桿菌的樣本，既有上述2種通用引物的表達(dá)，又有齒雙歧桿菌特異性引物的表達(dá)(圖2)。M：DNA Marker;S：唾液;W：白堊斑菌斑;D：齲壞組織;1：雙歧桿菌通用引物;2：細(xì)菌通用引物醫(yī).學(xué).全.在.線f1411.cn。
3 討論
菌斑細(xì)菌在齲病發(fā)病中占有重要地位。根據(jù)生態(tài)菌斑學(xué)說(shuō)，兒童齲的發(fā)生并不是單一致齲菌的作用，而是口腔生態(tài)平衡失調(diào)導(dǎo)致由變異鏈球菌、乳桿菌、放線菌、韋榮菌、奈瑟菌等口腔常駐菌共同作用的結(jié)果[10]。本研究結(jié)果顯示，30例無(wú)齲兒童均未檢出雙歧桿菌，40例S-ECC兒童有19例檢出雙歧桿菌，檢出率為47.5%。雙歧桿菌在不同部位的檢出率分別為：唾液27.5%，光滑面菌斑27.5%，白堊斑菌斑20.0%，深齲齲壞組織22.5%;齒雙歧桿菌在不同部位的檢出率分別為：唾液10.0%，光滑面菌斑7.5%，白堊斑菌斑7.5%，深齲齲壞組織10.0%。由此可見(jiàn)，雙歧桿菌在S-ECC兒童齲齒發(fā)生的不同階段均有檢出，推測(cè)其存在和口腔環(huán)境有關(guān)，并伴隨齲齒發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程;齒雙歧桿菌的檢出情況也證明其為口腔雙歧桿菌的活躍菌種[11]。本試驗(yàn)進(jìn)行的PCR鑒定結(jié)果顯示：S1、W1、D1為不同部位樣本與雙歧桿菌通用引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物;S2、W2、D2為其與細(xì)菌通用引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物(圖1);所有樣本均有細(xì)菌通用引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，但只有定植著雙歧桿菌的樣本才有其特異性表達(dá)。在口腔雙歧桿菌中，齒雙歧桿菌最早被檢出，其性狀也最為活躍，S3、W3、D3為其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性表達(dá)(圖2)。Becker等[3]的研究表明，S-ECC兒童的雙歧桿菌檢出率可達(dá)70%，并推測(cè)它可能是深齲的主要致齲菌。
