醫(yī)學(xué)免費(fèi)論文:NF�拨蔅及其相關(guān)炎性因子致大鼠移植肝冷保存損傷的機(jī)制

凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assays, EMSA)按YANG等[8]的方法提取肝組織的核蛋白，-70℃凍存?zhèn)溆�，用考馬斯亮藍(lán)蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所產(chǎn)品)測(cè)定蛋白濃度。結(jié)合NF�拨蔅的寡核苷酸探針(上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成)雙鏈核苷酸序列為5′�睞GT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C��3′，3′�睺CA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G��5′，以γ��32P�睞TP(北京福瑞生物工程公司產(chǎn)品)進(jìn)行探針標(biāo)記。室溫下將2μL 5×凝膠滯留結(jié)合緩沖液、核蛋白10μg、鮭精DNA(4g/L)1μL混勻，10min后加入γ��32P�睞TP標(biāo)記的NF�拨蔅探針2μL，反應(yīng)30min后加入5×上樣緩沖液2μL，60g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳2h(110V)后，-70℃放射自顯影6h。X光片置于BIO�睷AD凝膠圖象分析系統(tǒng)測(cè)定NF�拨蔅活性值(A值)來(lái)表示提取物中NF�拨蔅的DNA結(jié)合活性。NF�拨蔅活性值(A)=滯后帶吸光度值(A)×滯后帶面積值(S)。

1.3.2 冷保存期肝組織TNF�拨梁虸L��1β的測(cè)定

采用免疫組化SABC法在石蠟切片上測(cè)定TNF�拨梁虸L��1β的表達(dá)。TNF�拨梁虸L��1β主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，表現(xiàn)為胞質(zhì)黃染或棕黃色顆粒。免疫組化染色結(jié)果判定參照MATTERN的方法[9]。陽(yáng)性染色深度：未見(jiàn)染色為0，輕度染色(染成淺黃色)為1，中度染色(染成棕黃色)為2，深度染色(染成棕褐色)為3;陽(yáng)性細(xì)胞百分比：未見(jiàn)染色為0，染色細(xì)胞<25%為1，25%～50%為2，>50%為3。將這兩方面得分相加，得分0～2分判為陰性表達(dá)，>2分(3～6)判為陽(yáng)性表達(dá)。每組10例標(biāo)本，每例標(biāo)本隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野，記數(shù)100個(gè)細(xì)胞判定此例標(biāo)本的表達(dá)為陽(yáng)性或陰性，并計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率。

1.3.3 TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡

肝組織石蠟切片厚4μm，采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)。按DeadEndTM TUNEL檢測(cè)試劑盒(Promage, USA)操作說(shuō)明進(jìn)行操作。陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕黃色著色。每張切片光鏡(20×15)觀察10×500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算每100個(gè)細(xì)胞中平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，即凋亡指數(shù)(apoptosis index, AI)。

1.3.4 再灌注后血清TNF�拨�、IL��1β的測(cè)定

血清TNF�拨�、IL��1β采用雙抗體夾心ELISA法，試劑盒購(gòu)自晶美生物工程公司，采用德國(guó)FLUO star OPTIMA高通量微板測(cè)試系統(tǒng)測(cè)定。

1.3.5 再灌注后血清ALT、AST的檢測(cè)

采用日立生化分析儀7160，進(jìn)行血清ALT、AST的檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各組樣本間均數(shù)用單因素方差分析比較，各組間陽(yáng)性率用四格表的確切概率法比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠肝移植模型的制備情況

正式實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行大鼠肝移植手術(shù)30例，手術(shù)死亡3例，成功率90%。供體手術(shù)(18.6±5.2)min，供肝修整(8.5±3)min;受體手術(shù)(30.2±6.4)min，無(wú)肝期(15.5±3.3)min。門靜脈開放后，肝臟顏色迅速變紅，并可以看到少量金黃色膽汁分泌。3h時(shí)存活受體大鼠可自行活動(dòng)、飲水，滿足獲取標(biāo)本需要。

2.2 肝組織冷缺血期和再灌注期NF�拨蔅的測(cè)定結(jié)果

NF�拨蔅在B組和C組冷保存期均呈現(xiàn)不同程度活化，組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。D組同其他冷保存組相比，NF�拨蔅活性顯著增高(P<0.05)。再灌注后，B組、C組和D組NF�拨蔅活性均較假手術(shù)組活性水平增高(P<0.05)。隨著冷保存時(shí)間的延長(zhǎng)，NF�拨蔅活性增高(P<0.05，表1、圖1)。表1 不同冷保存時(shí)間組移植肝NF�拨蔅的活性(略)

2.3 冷保存期肝組織TNF�拨痢�IL��1β的測(cè)定結(jié)果

隨著冷保存時(shí)間的延長(zhǎng)，TNF�拨梁虸L��1β在肝組織中的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，D組TNF�拨梁虸L��1β的陽(yáng)性表達(dá)率較A、B、C組明顯升高(P<0.05，表2)。表2 不同冷保存時(shí)間肝組織TNF�拨良癐L��1β的表達(dá)(略)

2.4 再灌注期血清TNF�拨�、IL��1β及ALT、AST的測(cè)定結(jié)果醫(yī).學(xué).全.在.線f1411.cn

再灌注后，B、C、D組TNF�拨梁虸L��1β均較假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)，而且隨著冷保存時(shí)間延長(zhǎng)，兩種細(xì)胞因子活性均升高(P<0.05)。隨著冷保存時(shí)間的延長(zhǎng)，再灌注后血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。表3 再灌注后血清TNF�拨�、IL��1β、ALT、AST水平和細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)的變化(略)

2.5 再灌注后肝細(xì)胞的凋亡情況

凋亡細(xì)胞在TUNEL染色中顯示為棕色或褐色小點(diǎn)。A組為正常肝組織，凋亡細(xì)胞罕見(jiàn);隨著冷保存時(shí)間的延長(zhǎng)，移植肝再灌注后凋亡細(xì)胞在B、C、D組中表達(dá)逐漸增多，在中央靜脈周圍分布較多。經(jīng)統(tǒng)計(jì)后得出：隨著冷保存時(shí)間的延長(zhǎng)AI值逐漸升高，B、C 、D組AI值均較A組明顯升高(P<0.05)，而且組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3、圖2)。

3 討 論

NF�拨蔅是一類能與多種基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子κB位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。胞質(zhì)中的NF�拨蔅/I�拨蔅三聚體，可被TNF�拨痢�IL��1β、活性氧等多種細(xì)胞外刺激信號(hào)激活，繼而NF�拨蔅活化入核，與靶基因特異性序列結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物包括黏附分子、趨化因子和細(xì)胞因子(TNF�拨�、IL��1β)等，這些炎性介質(zhì)參與P/RI的病理過(guò)程[10]。

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