 |
 |
2.4 抑制劑對(duì)肝勻漿中HL活性的影響
配制上述優(yōu)化pH值9.5的TrisHC1系統(tǒng)，加入50 μL肝勻漿及相同量的相關(guān)的試劑，并加入鹽酸氯丙嗪至終濃度1、5、25 μmol/L，或加入SDS至終濃度0.01、0.1、1.0 mol/L，37 ℃、溫育反應(yīng)30 min,按上述方法操作檢測(cè)體系中HL活性，確定氯丙嗪、SDS對(duì)勻漿中HL活性的影響醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站f1411.cn。
2.5 FTZ不同調(diào)脂組分對(duì)大鼠肝HL的影響
在上述優(yōu)化pH值9.5的TrisHC1的反應(yīng)系統(tǒng)中，加入50 μL肝勻漿量和相同量的相關(guān)試劑并加FTZ的不同活性成分至不同濃度(0.1、0.50、2.50 μg/mL)于37 ℃、溫育反應(yīng)30 min,按上述方法操作，測(cè)定FTZ不同組分各種濃度時(shí)肝勻漿中HL酶的活性，確定對(duì)勻漿中HL活性的影響。
2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
以SPSS16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,所有結(jié)果用以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,各均數(shù)間用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性。
3 結(jié) 果
3.1 HL活性測(cè)定的酶量曲線
以肝組織勻漿上清作為標(biāo)本,測(cè)定不同勻漿蛋白量時(shí)HL酶活性，結(jié)果如圖1。由圖1 可見(jiàn),勻漿量在0～50 μL 之間，HL酶活性隨著勻漿蛋白量的增加而遞增，勻漿蛋白量與酶活性之間呈一直線關(guān)系(r=0.998 8)。
3.2 pH值對(duì)肝勻漿中肝脂酶活性的影響
TrisCl反應(yīng)體系的pH不同，測(cè)得50 μL 肝勻漿的HL活性明顯不同,說(shuō)明pH對(duì)肝勻漿的HL活性有明顯的影響(見(jiàn)表1)，其最適反應(yīng)體系pH是9.5，此時(shí)酶比活性最大。表1 不同反應(yīng)體系pH值對(duì)大鼠肝HL活性的影響
3.3 肝脂肪酶活性與反應(yīng)時(shí)間曲線
在0～90 min內(nèi)，酶活性隨溫育時(shí)間延長(zhǎng)而增加，溫育90 min HL活性達(dá)最大值4.98 U，溫育30 min HL活性達(dá)最大值的91.5%(4.61 U)，但超過(guò)90 min，HL活性反而顯下降趨勢(shì)(見(jiàn)圖2)。為方便試驗(yàn)，選擇30 min作為其他實(shí)驗(yàn)溫育時(shí)間。
3.4 溫度對(duì)大鼠勻漿HL活性的影響
肝勻漿中HL活性在25 ℃，保存24 h，酶活性下降80%，4 ℃保存24 h酶活性下降35%，在-20 ℃保存24 h，酶活性下降5%，在-70 ℃，保存24 h，酶活性下降3%。說(shuō)明肝勻漿中HL活性在室溫下不穩(wěn)定，在4 ℃也不夠穩(wěn)定。在-20 ℃和-70 ℃下保存HL酶活性較穩(wěn)定。
大鼠肝勻漿制備后，立即加入DTT至終濃度為1 mmol/L的肝勻漿中HL酶活性在25 ℃，保存24 h，HL酶活性只下降40%，說(shuō)明DTT對(duì)肝勻漿中HL酶活性有保護(hù)作用。加入DTT至1 mmol/L的肝勻漿在-70 ℃下保存1個(gè)月，仍有很高HL酶活性，相當(dāng)于剛制備的肝勻漿HL酶活性的95%(見(jiàn)表2)。說(shuō)明肝勻漿加入DTT在-70 ℃低溫冷凍條件下可較長(zhǎng)時(shí)間保存而維持其HL酶活性相對(duì)穩(wěn)定。表2 不同保存條件下大鼠肝勻漿HL活性變化
3.5 鈣濃度對(duì)大鼠勻漿肝HL酶活性的影響
在鈣濃度為0.001、0.005、0.025、0.10 mol/L的反應(yīng)體系中,大鼠肝勻漿中HL酶活性分別比無(wú)鈣反應(yīng)體系增加3～9倍,鈣濃度為0.005 mol/L時(shí)HL酶活性增加最大達(dá)9倍(見(jiàn)表3)，表明體系中游離鈣濃度(Ca2+)對(duì)大鼠肝勻漿中HL活性有激活作用。表3 鈣濃度對(duì)大鼠肝HL活性的影響
3.6 抑制劑對(duì)大鼠肝HL的影響
在最適pH9.5的TrisCl反應(yīng)體系中，加入氯丙嗪至終濃度分別為1、5、25 μmol/L，HL酶活性分別下降35%、56.7%、75.1%。
在最適pH9.5的TrisCl反應(yīng)體系中加入SDS至終濃度分別為0.01、 0.1、1.0 mol/L，HL酶活性分別下降36.2%、64.8%、94.0%醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站f1411.cn。
3.7 FTZ 不同組分對(duì)大鼠肝勻漿HL活性的影響
0.1～2.5 μg/mL 的FTZ提取物及其活性成分齊墩果酸、三七總皂苷、人參皂苷Rb2能濃度依賴性增強(qiáng)HL活性，增加幅度可達(dá)75%，而高濃度鹽酸小檗堿則可抑制HL活性，抑制率可達(dá)40%;丹參素對(duì)HL活性影響不明顯(見(jiàn)圖3)。
4 討 論
肝脂酶(HL)是一種由肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成和分泌的糖蛋白,主要轉(zhuǎn)運(yùn)到肝竇狀隙內(nèi)皮細(xì)胞表面而發(fā)揮生理作用，并在肝中降解 [1，2]。 HL主要生理功能是水解各種脂蛋白中的三酰甘油和磷脂,在乳糜微粒殘骸的清除、低密度脂蛋白的形成和膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)中起關(guān)鍵作用[1，2]。HL酶活性降低可引起血脂水平(主要為三酰甘油)升高、HDLC降低，進(jìn)而影響到動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[1-3] ;HL活性的降低還與脂肪肝形成有關(guān)[4，5]。維持HL酶活性對(duì)調(diào)節(jié)血脂、防治抗動(dòng)脈粥樣硬化和脂肪肝有重要意義。
