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1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理
將細(xì)胞隨機(jī)分成三組(n=8)：對(duì)照組、高糖組和辛伐他汀組。細(xì)胞同步化處理后，對(duì)照組加正常培養(yǎng)液，高糖和辛伐他汀組在培養(yǎng)液中加入葡萄糖，終濃度為30 mmol/L, 辛伐他汀組同時(shí)加入終濃度為1 μmol/L辛伐他汀。分別于高糖處理6,12,24,48,72 h時(shí)檢測(cè)α-SMA表達(dá)情況。
1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)α-SMA的表達(dá)情況用4%多聚甲醛在4 ℃下固定細(xì)胞10 min后用3%H2O2處理10 min，用10%羊血清封閉10 min，加一抗4 ℃下孵育12 h。加二抗室溫孵育2 h,DAB顯色。在顯微鏡下，隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞百分比 (陽(yáng)性細(xì)胞百分比=該視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/該視野總細(xì)胞數(shù)×100%) ，取平均值做為該孔的陽(yáng)性細(xì)胞百分比。
1.5 Western blot測(cè)定α-SMA的表達(dá)按照蛋白質(zhì)抽提試劑盒說(shuō)明進(jìn)行蛋白提取。用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。10%SDS-PAGE電泳，低壓半干轉(zhuǎn)膜3 h后進(jìn)行免疫反應(yīng)，加入α-SMA一抗4 ℃下孵育12 h。加二抗室溫下孵育2 h后，DAB顯色10 min后采像。用圖象分析軟件Image Pro Plus 6.0對(duì)目標(biāo)條帶積分光密度值(IOD)進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)條帶的IOD比內(nèi)參的IOD值做為α-SMA的相對(duì)表達(dá)量。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
計(jì)量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(x±s),采用單因素方差分析。用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)α-SMA表達(dá)α-SMA陽(yáng)性表達(dá)為胞漿中出現(xiàn)黃褐色呈紡垂形或放射狀分布絲狀物(圖1~6)。對(duì)照組各時(shí)間段內(nèi)均無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，高糖組和辛伐他汀組均在6 h出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，48小時(shí)達(dá)高峰， 并持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。與高糖組比較，辛伐他汀組各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞均明顯減少(見表1)。
2.2 Western blot檢測(cè)α-SMA結(jié)果對(duì)照組各時(shí)間段內(nèi)均表達(dá)量極低，高糖組從6 h出現(xiàn)表達(dá)， 并持續(xù)增高至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。與高糖組比較，辛伐他汀組各時(shí)間點(diǎn)α-SMA表達(dá)均減少(見表2)。
表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)α-SMA表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞百分比比較(略)
與對(duì)照組比較，^P<0.05;與高糖組比較，#P<0.05
表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)Western blot檢測(cè)的α-SMA 表達(dá)結(jié)果比較(略)
與對(duì)照組比較，^P<0.05;與高糖組比較，#P<0.05
3 討論
轉(zhuǎn)分化是指細(xì)胞在病理情況下失去其特有的表型，獲得新的表型，轉(zhuǎn)化為另一種細(xì)胞的過(guò)程。正常情況下腎小管上皮細(xì)胞不表達(dá)α-SMA，但在病理狀態(tài)下各種損傷刺激均可啟動(dòng)腎小管上皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation,TEMT)，腎小管上皮細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為Myof，并表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白—α-SMA。因此實(shí)驗(yàn)研究中以α-SMA作為腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的標(biāo)志，只要細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)α-SMA，無(wú)論其表達(dá)量的多少，均可認(rèn)為細(xì)胞發(fā)生了轉(zhuǎn)分化[12]。此時(shí)細(xì)胞極性消失，細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間的連接結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞骨架蛋白重塑，細(xì)胞移行及侵襲能力均增強(qiáng)，同時(shí)具有十分活躍的增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的功能，這些改變都直接參與了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生和發(fā)展。轉(zhuǎn)分化中形成的Myof是間質(zhì)中合成細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞，Myof數(shù)目的多少直接決定了腎間質(zhì)纖維化病變的程度及纖維化進(jìn)展的速度。
在本實(shí)驗(yàn)中觀察到，用高糖刺激大鼠腎小管上皮細(xì)胞，6 h少數(shù)細(xì)胞開始表達(dá)α-SMA,并持續(xù)到72 h。說(shuō)明高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞可引起腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分為肌成纖維細(xì)胞。而且隨刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)生肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的腎小管上皮細(xì)胞不斷增加。72 h后發(fā)生轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞可達(dá)到80%左右。TEMT的發(fā)生必然會(huì)引起腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生�？梢娕R床上糖尿病患者血糖控制不良可能是促進(jìn)糖尿病患者腎臟發(fā)生TEMT并最終進(jìn)展為終未期腎衰的重要原因。因此，嚴(yán)格控制血糖并防止和逆轉(zhuǎn)糖尿病時(shí)的TEMT可能成為治療糖尿病腎病進(jìn)展為終未期腎衰的重要手段醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站f1411.cn。
辛伐他汀是目前治療高血脂的重要藥物，最近研究發(fā)現(xiàn)其具有抗纖維化作用[3-5]以及影響細(xì)胞增殖和分化[13-15]，同時(shí)具有腎臟保護(hù)作用，推測(cè)其腎臟保護(hù)作用可能與抑制TEMT有關(guān)。因此本研究用辛伐他汀來(lái)處理高糖刺激的腎小管上皮細(xì)胞，在動(dòng)態(tài)觀察的過(guò)程中，觀察到辛伐他汀能夠顯著抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的發(fā)生，雖然并沒(méi)有完全的抑制TEMT的發(fā)生，但這一結(jié)果在臨床上仍然是非常有價(jià)值的。盡管辛伐他汀尚不能完全阻止糖尿病腎病的發(fā)生，但至少可以明顯的減緩糖尿病腎病進(jìn)展為終未期腎衰的進(jìn)程。這將為辛伐他汀在臨床上用于糖尿病腎病腎纖維化的治療提供新的理論依據(jù)。同時(shí)也說(shuō)明對(duì)這一疾病的治療，辛伐他汀是不能完全勝任的，應(yīng)采取綜合措施，取長(zhǎng)補(bǔ)短以求得最佳療效。同時(shí)實(shí)驗(yàn)中雖然證實(shí)辛伐他汀具有抑制轉(zhuǎn)分的作用，但沒(méi)有驗(yàn)證辛伐他汀是否具有逆轉(zhuǎn)TEMT的作用，同時(shí)其抑制轉(zhuǎn)分化的作用與藥物的作用時(shí)間藥物劑量之間的量化關(guān)系也不清楚，因此辛伐他汀在臨床上用于糖尿病腎病治療的最佳時(shí)機(jī)以及最佳劑量和療程等很多問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究。
