醫(yī)學(xué)論文范文:聚乙二醇修飾海葵神經(jīng)毒素rhk2a的分離與純化

用pH4.0的0.02 mol/L醋酸鹽緩沖溶液平衡SP��650S強(qiáng)陽離子交換柱后上樣,mPEG�瞨hk2a修飾反應(yīng)所得混合產(chǎn)物依次采用鹽離子濃度梯度逐漸變緩的3組緩沖液進(jìn)行洗脫，分離結(jié)果分別如圖1的A、B、C所示洗脫液中溶液電導(dǎo)率在5～7 ms/cm時，mPEG�瞨hk2a能被洗脫下來，鹽離子濃度梯度變化越緩，mPEG�瞨hk2a修飾產(chǎn)物各洗脫峰的分離度越高，則可將色譜圖3所對應(yīng)的洗脫條件作為強(qiáng)陽離子交換層析法的最佳分離條件。

收集在最佳分離條件(第3組緩沖液洗脫)下的吸收峰①、②、③、④所對應(yīng)的流出液，超濾除鹽、凍干，將分離產(chǎn)物進(jìn)行SDS�睵AGE電泳檢測，結(jié)果如圖2所示：mPEG修飾產(chǎn)物與未修飾的rhk2a得到很好的分離，由各電泳條帶的分子量初步判斷，單修飾產(chǎn)物mPEG�瞨hk2a在峰③中出現(xiàn)。

3.3 CM��650S弱陽離子交換層析法分離修飾產(chǎn)物

用pH 4.0的0.02 mol/L醋酸鹽緩沖溶液平衡CM��650S弱陽離子交換柱后上樣，mPEG�瞨hk2a修飾反應(yīng)所得混合產(chǎn)物，依次更換含NaCl鹽離子濃度不同的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫,結(jié)果如圖3所示,主要修飾產(chǎn)物被穿流洗出。收集圖3中吸收峰①、②、③所對應(yīng)的流出液，超濾除鹽、凍干，將分離產(chǎn)物進(jìn)行SDS�睵AGE電泳檢測，結(jié)果如圖4所示：mPEG�瞨hk2a修飾產(chǎn)物主要在穿透峰中出現(xiàn)，未修飾的rhk2a在0.1

4 討 論

由于mPEG�瞨hk2a偶聯(lián)蛋白異構(gòu)體除了分子量和表面電荷的細(xì)小差別之外，其他的理化性質(zhì)非常接近，因此偶聯(lián)產(chǎn)物的分離純化一直是蛋白質(zhì)PEG化技術(shù)的難點之一。蛋白質(zhì)與PEG偶聯(lián)之后表面電荷會發(fā)生變化，利用這種電荷差異可以將偶聯(lián)蛋白分離，故國內(nèi)外多采用離子交換層析法分離PEG修飾混合物[7]。

rhk2a中N�材┒税被�與mPEG共價結(jié)合后，失去與氫質(zhì)子的結(jié)合能力，蛋白質(zhì)分子中的正電荷會減少，因此mPEG�瞨hk2a的等電點比rhk2a低。另一方面，由于mPEG長鏈會阻礙rhk2a與離子交換劑之間的電荷相互作用，即產(chǎn)生立體屏蔽作用，導(dǎo)致mPEG�瞨hk2a在離子交換層析中的流出行為與rhk2a有所不同。這兩方面因素決定采用離子交換層析法能夠分離純化mPEG�瞨hk2a修飾反應(yīng)混合物[7]。

由于陰離子交換樹脂結(jié)合的主要是蛋白質(zhì)的羧基，受氨基修飾影響較小，因而選擇陽離子交換樹脂分離純化mPEG�瞨hk2a。本文實驗結(jié)果也證明，用強(qiáng)陽離子交換層析法分離mPEG�瞨hk2a修飾反應(yīng)混合物時，修飾產(chǎn)物mPEG�瞨hk2a在柱上的保留時間比未修飾的rhk2a要短。說明mPEG修飾確實降低了rhk2a的等電點，屏蔽了rhk2a與離子交換劑之間的靜電作用，使得在相同pH值條件下，修飾產(chǎn)物在柱上的吸附能力較弱。

用弱陽離子交換層析法分離mPEG�瞨hk2a時，mPEG�瞨hk2a修飾產(chǎn)物主要在穿透峰中出現(xiàn)，是因為mPEG修飾顯著地降低了mPEG�瞨hk2a的等電點，導(dǎo)致弱陽離子交換層析柱對mPEG�瞨hk2a的結(jié)合力太弱，無法獲得理想的分離效果。

本研究證明，修飾產(chǎn)物mPEG�瞨hk2a,在平衡液的pH值為4.0時，與SP��650S強(qiáng)陽離子交換層析柱有良好的結(jié)合;在洗脫液中溶液電導(dǎo)率在5～7 ms/cm時，可被洗脫下來，并且與未修飾的rhk2a分離度良好，因此獲得了純度較高的mPEG�瞨hk2a，為下一步的深入研究奠定了基礎(chǔ)醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站f1411.cn。

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