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1.2.4 DAPI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取固定好的細(xì)胞爬片，常規(guī)水化后滴加濃度為100ng/ml的DAPI染液，室溫染色10min，流水沖去染液，濾紙吸除多余水分，加一滴熒光封片液，置于熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng)360-400nm。
陽(yáng)性結(jié)果判斷：細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期，Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)； a Ⅱ 期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化； b Ⅱ 期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。
1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR)檢測(cè)Bcl-2和Bax mRNA水平 細(xì)胞培養(yǎng)至完全匯合時(shí)，使用TaKaRa TRIZOL Reagent Kit，按說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。從Primer Bank中獲得人類(lèi)Bcl-2和Bax基因引物序列。人Bcl-2上游引物為： 5- CCAAGAATGCAAAGCACACTG-3 ，下游引物：5-CCCAGCCTCCGTTATCCTG -3，擴(kuò)增片段為711bp；Bax上游引物為：5-CTGGACAGTAACATGGAGCTG-3 ，下游引物為 5-GGCGTCCCAAAGTAGGAGA-3，擴(kuò)增片段為296bp。人β-actin作為內(nèi)參照，引物序列如下：上游為5-CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC-3，下游為5-CTCCTT AAT GTC ACG CAC GAT-3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為250bp，引物由上海生工合成。PCR產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖凝膠分析。醫(yī).學(xué).全.在.線(xiàn)f1411.cn
1.2.6 Western blotting檢查磷酸化p38表達(dá)：用0.01M PBS沖洗培養(yǎng)融合至80%的細(xì)胞，加入450μl裂解液（1mM NaHCO3和10mM PMSF)后用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下收集到EP管中，15，000rpm離心，收集上清蛋白樣品，用BCA ProteinAssay Kit（美國(guó)Pierce公司)對(duì)每種蛋白樣品定量。每種樣品取20μg進(jìn)行變性蛋白電泳，凝膠濃度為12%。電泳結(jié)束后將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上（美國(guó)Millipore公司)，5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜后，將硝酸纖維素膜放入一抗室溫孵育1h。洗膜后，將膜與HRP-結(jié)合的二抗室溫孵育1h。洗膜后用ECL Westernblotting system（美國(guó)GE公司)顯色。
1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s)表示，并用SPSS軟件16.0進(jìn)行t檢驗(yàn)或單因素方差分析。
2 結(jié)果
2.1 Claudin-6誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡 為了檢測(cè)claudin-6是否能夠誘發(fā)MCF-7細(xì)胞凋亡，應(yīng)用TUNEL法、DAPI stain和Annexin-V/PI double stain檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率與vector組比較明顯增高。同時(shí)DAPI核染色發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)定表達(dá)claudin-6的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中可見(jiàn)明顯的凋亡細(xì)胞核形態(tài)，即細(xì)胞核呈波紋狀，染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化，部分細(xì)胞核裂解為碎塊。而control組細(xì)胞的自然凋亡率與vector組比較，差異無(wú)顯著性意義，結(jié)果如圖4所示。上述結(jié)果說(shuō)明，claudin-6促進(jìn)了MCF-7細(xì)胞凋亡。
2.2 Claudin-6刺激MCF-7細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活 ERK、p38 MAPK和PI3KMAPK等信號(hào)途徑在細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)中發(fā)揮了重要作用。 在claudin-6表達(dá)的MCF-7細(xì)胞中，claudin-6是否激活這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控？應(yīng)用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中上述信號(hào)途徑的激活情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在claudin-6表達(dá)的MCF-7細(xì)胞中p38 MAPK途徑明顯處于激活狀態(tài)，如圖5、6所示。上述結(jié)果提示claudin-6表達(dá)激活了p38 MAPK途徑。
2.3 抑制劑對(duì)不同信號(hào)途徑的抑制作用 為進(jìn)一步明確p38 MAPK信號(hào)途徑在claudin-6介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用，我們應(yīng)用該信號(hào)途徑特異性抑制劑，觀察其是否能選擇性阻斷相應(yīng)的信號(hào)途徑：p38 MAPK抑制劑SB203508。應(yīng)用Western blot檢測(cè)p38 MAPK信號(hào)途徑活化狀態(tài)，結(jié)果如圖7-12所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)p38 MAPK途徑的確能夠被特異性抑制劑SB203580明顯抑制，而claudin-6的表達(dá)未受影響。醫(yī).學(xué).全.在.線(xiàn)f1411.cn
2.4 p38 MAPK信號(hào)途徑在表達(dá)claudin-6的MCF-7細(xì)胞中凋亡調(diào)控的作用 為明確p38 MAPK途徑在claudin-6誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡中的作用，我們用SB203580處理各組細(xì)胞，然后應(yīng)用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用SB203580阻斷p38MAPK途徑后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞claudin-6的促凋亡作用被抑制，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡降低，如圖13、14所示。上述結(jié)果表明，MCF-7細(xì)胞中claudin-6的促凋亡作用是通過(guò)p38 MAPK途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)的。
