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使用 epidesigner設(shè)計引物，正向引物：5-TGATATAGTTTTGTTTTTGGATGGG-3，反向引物：5-AATAAAAACTC TCCAATACCACTTCC-3。擴(kuò)增片段大小為 200～600 bp。在正向引物5端加入10 mer 標(biāo)記序列，用于平衡PCR反應(yīng)；反向引物5端加入 T7啟動子序列，用于后續(xù)的體外轉(zhuǎn)錄。
2.2.2 PCR反應(yīng)和產(chǎn)物純化
使用 EZ 96 DNA Methylation Kit (Zymo Research公司 美國)進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化反應(yīng)。以轉(zhuǎn)化后的DNA為模板，在384孔板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增反應(yīng)。每個反應(yīng)總體積5ｕl，包含模板 DNA 1 ｕl （DNA濃度>5 ηg/ｕl)，5 U/ｕl Hotstar Taq酶 0.2 U，引物每條1 pmol， 25 mmol/LdNTP 0.04 ｕl，反應(yīng)條件為 94 ℃ 15 min；94 ℃20 s, 62 ℃30 s， 72 ℃1 min，45 個循環(huán)；72℃ 3 min；4℃放置。PCR反應(yīng)產(chǎn)物使用 2ｕl蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP)處理，去除體系中游離的dNTP。反應(yīng)體系 7 ｕl，其中 PCR產(chǎn)物 5 ｕl，SAP混合液 2 ｕl(SAP 0.3 ｕl, RNase-free ddH2O 0.17 ｕl)。反應(yīng)程序 37 ℃ 20 min；85 ℃ 5 min；4 ℃放置。
2.2.3 體外轉(zhuǎn)錄及RNase A特異性酶切反應(yīng)
體外轉(zhuǎn)錄與酶切反應(yīng)同時進(jìn)行，總體積7 ｕl反應(yīng)體系包含SAP處理后 PCR產(chǎn)物 2 ｕl，RNase-free ddH2O 3.15 ｕl， 5×T7聚合酶緩沖液 0.89 ｕl ， T裂解混合液 0.24 ｕl ， 100 mmol/LDTT 0.22 ｕl ，T7 RNA & DNA 聚合酶 0.44 ｕl ，RNase A 0.06 ｕl。反應(yīng)程序為37 ℃ 3 h，4 ℃放置。 每個樣品中加水20 ｕl稀釋，震蕩混勻，加入 6 mg 清潔樹脂純化 10 min，3 200×g離心5 min。
2.2.4 芯片點樣及質(zhì)譜檢測
使用點樣儀（型號Mass ARRAY Nanodispenser RS1000 SEQUENOM公司 美國)將純化后產(chǎn)物點至384 孔SpectroCHIP (SEQUENOM公司 美國)芯片上， 將點制好的芯片放入質(zhì)譜儀 （型號Mass ARRAY Compact System SEQUENOM公司 美國)進(jìn)行檢測。 SpectroCHIP芯片使用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析技術(shù)（matrix-assisted laserdesorption/ionization –time of flight, MALDI-TOF)進(jìn)行檢測，檢測數(shù)據(jù)通過EpiTYPER軟件（SEQUENOM公司 美國)分析并輸出結(jié)果。
2.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理
對數(shù)據(jù)采用SPSS10.0 統(tǒng)計軟件分析，行t檢驗。
3 結(jié)果
3.1 EYA1突變檢測結(jié)果
在先天性小耳畸形患者中共檢測到4 種EYA1核苷酸改變，分別為：①位于外顯子3 的258G>A Q86Q（1 例散發(fā)患者，純合突變)；②位于外顯子7的 813A>G T271T（1 例家系患者和 2 例散發(fā)患者，均為純合突變)；③位于外顯子12 的 1278C>T G426G（3例家系患者雜合突變，6 例家系患者純合突變，5 例散發(fā)患者雜合突變，9 例散發(fā)患者純合突變)；④位于外顯子 16的 1755T>C H585H（6例家系患者雜合突變，8 例家系患者純合突變，10例散發(fā)患者雜合突變醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站f1411.cn，15 例散發(fā)患者純合突變)。其編碼蛋白質(zhì)均未見改變，均為單核苷酸多態(tài)（Single Nucleotide Polymorphism SNP)。
3.2 EYA1甲基化檢測結(jié)果EYA1 基因啟動子區(qū)域 CpG 島(胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸相對集中區(qū)域)共 21 個位點，共分為13 個單元(Unit)， 分別為 CpG_Unit1 （位點 1， 2， 3) ， CpG_Unit2 （位點4) ， CpG_Unit3（位點 5，6，7)，CpG_Unit4（位點 8)，CpG_Unit5（位點 9，10)，CpG_Unit6（位點11，12，13)，CpG_Unit7（位點 14，15)，CpG_Unit8（位點16)，CpG_Unit9（位點 17)，CpG_Unit10（位點 18)，CpG_Unit11（位點 19)，CpG_Unit12（位點 20)，CpG_Unit13（位點21) 。 CpG_Unit8和CpG_Unit9因為分子量太小而未能檢測。 CpG_Unit11， CpG_Unit12和 CpG_Unit13 分子量與不含甲基化序列分子量相同，質(zhì)譜峰重疊不能檢測。實驗組CpG_Unit3 和 CpG_Unit5 甲基化程度較正常對照明顯降低，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；其余各CpG_Unit未見明顯改變。
