第13章 微生物疫苗
自我國首創(chuàng)用人痘預(yù)防天花后，18世紀(jì)末Jenner通過研究擠奶女工得牛痘后不再患天花這一現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)接種牛痘病毒可以預(yù)防天花，從而開創(chuàng)了疫苗（vaccine)接種的歷史。此后微生物疫苗迅速發(fā)展，炭疽、狂犬病減毒活疫苗和鼠疫、傷寒滅活疫苗等相繼問世。迄今，疫苗的發(fā)展歷經(jīng)三個(gè)主要階段：①古典疫苗時(shí)期：主要建立在對感染性疾病反復(fù)觀察和摸索的基礎(chǔ)上，以牛痘苗和狂犬病疫苗為代表；②培養(yǎng)疫苗時(shí)期：采用組織或細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可獲得許多減毒或滅活的疫苗，以脊髓灰質(zhì)炎疫苗、卡介苗等為代表；③基因工程疫苗時(shí)期：基因工程技術(shù)為疫苗的研制注入了全新的設(shè)計(jì)思路，最成功的例子是乙型肝炎基因工程疫苗。
現(xiàn)代疫苗學(xué)的發(fā)展策略主要是：①將病原微生物候選抗原基因克隆到合適的載體，再道入適宜的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)目的抗原遺傳信息；②選擇缺失基因的減毒病原體載體，插入一些外源基因，當(dāng)這些活載體疫苗進(jìn)行流產(chǎn)性復(fù)制時(shí)，表達(dá)出的抗原暴露于宿主免疫系統(tǒng)；③預(yù)防多種疾病、接種次數(shù)少的多價(jià)抗原聯(lián)合疫苗；④利用質(zhì)粒DNA誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的核酸疫苗；⑤疫苗的免疫增強(qiáng)物及對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)；⑥特定免疫原或免疫調(diào)節(jié)提呈的新型微載體系統(tǒng)。
疫苗的形式從過去較單一的滅活疫苗、減毒活疫苗，發(fā)展到現(xiàn)代的基因工程重組蛋白質(zhì)疫苗、化學(xué)合成多肽疫苗（包括表位疫苗)及核酸疫苗；疫苗的功能從預(yù)防發(fā)展到預(yù)防與治療；疫苗的范圍從微生物疫苗外延為腫瘤疫苗、抗心血管病疫苗、避孕疫苗等。
第一節(jié) 滅活疫苗
早期使用的主要是滅活疫苗（inactivated vaccine)，它是指用化學(xué)或物理的方法，將具有感染性的完整的病原體殺死，使其失去傳染性而保留抗原性，接種后可刺激宿主產(chǎn)生針對其抗原的免疫應(yīng)答，從而達(dá)到預(yù)防該病原體感染的目的的一類疫苗。
在制備滅活疫苗中，使用較多的滅活劑是甲醛，它具有滅活病原體活力與保留抗原性的雙重作用。對于病毒來說，理想的滅活劑應(yīng)能特異地作用于核酸而不影響衣殼或包膜蛋白，甲醛因能使蛋白質(zhì)變性，并不是一種理想的滅活劑。揮發(fā)性的β-丙內(nèi)酯僅作用于核酸使病毒滅活，已用于乙型腦炎疫苗、狂犬病疫苗等生產(chǎn)。
目前廣泛使用的滅活疫苗，國內(nèi)有傷寒疫苗、乙型腦炎疫苗、百日咳疫苗、鉤體病疫苗等，國外有鼠疫疫苗、流感疫苗、脊髓灰質(zhì)炎salk疫苗等。狂犬病滅活疫苗只在緊急情況下，給被瘋獸咬傷者使用。
滅活疫苗制造工藝相對簡單，免疫原性穩(wěn)定性高，易于制備多價(jià)疫苗，疫苗安全性高，儲存及運(yùn)輸方便，但也存在以下明顯不足之處：
（1)需要嚴(yán)格滅活 就強(qiáng)毒株而言，如果不進(jìn)行非常嚴(yán)格的滅活，則難以保證疫苗中不含有滅活不徹底的病原體。
（2)過敏反應(yīng) 免疫力不夠持久，需多次接種，劑量較大，有可能導(dǎo)致機(jī)體對接種的異種蛋白產(chǎn)生不良的過敏反應(yīng)。
（3)感染加重現(xiàn)象 某些滅活疫苗，如早期使用的麻疹疫苗、呼吸道合胞病毒疫苗，雖然可誘導(dǎo)產(chǎn)生一定的抗體，但一旦宿主被病原體感染后，產(chǎn)生臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度往往會超過未經(jīng)免疫者。
（4)免疫不全面 滅活疫苗不能模擬病原體在宿主中的自然感染過程，如無吸附、復(fù)制、釋放等，難以通過內(nèi)源性抗原加工提呈，抗原種類不夠全面，所接觸到的免疫細(xì)胞有限，因此，它主要刺激宿主產(chǎn)生體液免疫，不能產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答，特別是細(xì)胞免疫應(yīng)答。對于那些主要靠細(xì)胞免疫預(yù)防感染的病原體來說，免疫效果往往低下，甚至無效。
減毒活疫苗(live-attenuated vaccine)是指通過人工的方法，將病原體的毒力降低到足以產(chǎn)生模擬自然發(fā)生隱性感染，誘發(fā)理想的免疫應(yīng)答而又不產(chǎn)生臨床癥狀的一類疫苗。
減毒方法多為人工體外培養(yǎng)，最為經(jīng)典的減毒活疫苗為卡介苗（BacillusCalmeete Guerin， BCG)。1907～1920年，Calmette和Guerin將一株有毒的牛型結(jié)核桿菌接種在含有膽汁、甘油的馬鈴薯培養(yǎng)基中，連續(xù)傳代培養(yǎng)230代，歷時(shí)13年，獲得一株毒力減弱但仍保持高免疫原性的變異菌株，它可使接種動物產(chǎn)生對結(jié)核的免疫力。該菌株后來被命名為卡介苗，已在全球推廣應(yīng)用于結(jié)核病的預(yù)防接種。
目前，減毒活疫苗仍是預(yù)防接種中使用較多的一類疫苗，主要包括BCG、口服脊髓灰質(zhì)炎活疫苗（OPV)、麻疹疫苗、乙型腦炎減毒活疫苗、甲型肝炎疫苗等。
與滅活疫苗相比，減毒活疫苗的最大優(yōu)點(diǎn)是：能誘發(fā)全面、穩(wěn)定、持久的體液免疫、細(xì)胞免疫和粘膜免疫應(yīng)答；一般只須接種1次即可達(dá)到預(yù)防目的；可采用口服、噴鼻或氣霧途徑免疫，避免一些因注射免疫而引起的局部反應(yīng)或合并征。但由于使用了減毒的活的病原體，在制備和使用過程中存在一些安全性隱患問題，主要包括：
1．回復(fù)突變危險(xiǎn) 減毒活疫苗雖然毒力已降低到不足以引發(fā)臨床癥狀，但作為一種活的病原體，仍有毒力返祖的可能，并可能對被免疫者產(chǎn)生嚴(yán)重后果。
2．使用范圍相對狹窄 對于免疫功能低下或缺陷者，減毒活疫苗可能仍有一定的致病性，甚至誘發(fā)嚴(yán)重疾病，因此，一般也不提倡給孕婦使用。
3．外源性病原體污染 減毒活疫苗在體外傳代減毒過程中，培養(yǎng)基、細(xì)胞株或操作過程均有被外界病原體污染的可能性。
4．有效期短和熱穩(wěn)定性差 由于這類疫苗是活的病原體，因此，使用的有效期一般較短，在保存及運(yùn)輸上往往需要在低溫條件下進(jìn)行，如保存不當(dāng)可造成效價(jià)下降，甚至失效。
近年來，利用分子生物學(xué)技術(shù)，去除與毒力有關(guān)基因片段，使病原體毒力減低或喪失。因缺失突變毒株制成的疫苗稱為基因缺失活疫苗（gene deleted live vaccine)。與自然突變株（多為點(diǎn)突變毒株)相比，基因缺失活疫苗具有突變性狀明確、穩(wěn)定、不易發(fā)生毒力返祖的優(yōu)點(diǎn)。
對于某些抗原性弱且易于發(fā)生免疫逃避的病原體，常規(guī)疫苗往往難以獲得有效的免疫應(yīng)答及保護(hù)性。一些免疫保護(hù)機(jī)制不清，可能誘導(dǎo)免疫病理反應(yīng)，有潛在致腫瘤作用的病毒，以及不易培養(yǎng)的病原體，則難以用傳統(tǒng)方法生產(chǎn)疫苗。
為消除減毒活疫苗的回復(fù)突變和滅活全疫苗的感染性復(fù)活作用，提高疫苗的純度，最理想的是制備不含病原體核酸，僅含能誘發(fā)宿主產(chǎn)生中和抗體的微生物蛋白或表面抗原的疫苗，即亞單位疫苗(subunit vaccine)，其突出優(yōu)點(diǎn)是：已除去了病原體中不能激發(fā)機(jī)體保護(hù)性免疫和對宿主有害的部分，只保留有效的免疫原成分，因而免疫作用明顯增強(qiáng)而穩(wěn)定，可靠性不斷提高，對機(jī)體引起的不良反應(yīng)越來越小。
一、基因工程蛋白質(zhì)疫苗
基因工程疫苗(genetic engineering vaccine)是利用基因工程重組技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，將病原體中能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的抗原決定簇的編碼基因，導(dǎo)入細(xì)菌、酵母菌、昆蟲桿狀病毒或哺乳動物細(xì)胞等高效表達(dá)，再通過提取、純化目的蛋白而制成。不同表達(dá)系統(tǒng)的差別主要是蛋白質(zhì)翻譯后加工的不同，如通常在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)最接近天然抗原，而在細(xì)菌內(nèi)不能進(jìn)行蛋白質(zhì)的糖基化，酵母菌中則可能過度糖基化。
基因工程疫苗可以通過MHCⅡ類分子限制性激活CD4細(xì)胞而使宿主產(chǎn)生針對目的蛋白的中和抗體，其研制成功的關(guān)鍵在于選擇強(qiáng)免疫原性的病原體蛋白亞單位。這些亞基往往是病原體表面的親水亞基（表面結(jié)構(gòu)蛋白)，如乙型肝炎病毒HBsAg、巨細(xì)胞病毒糖蛋白gpB、EB病毒包膜糖蛋白gp350、流感病毒血凝素（HA)和（神經(jīng)氨酸酶（NA)、艾滋病病毒包膜糖蛋白gp120和gp41等。另外，所表達(dá)的目的蛋白的空間構(gòu)象及氨基酸序列是否與病原體的天然蛋白一致，也與基因工程疫苗的保護(hù)性顯著相關(guān)。因此，對不同的病原體亞單位需用不同類型的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。
目前，基因工程疫苗發(fā)展的重點(diǎn)為：①不能或難以培養(yǎng)的病原體，如乙型肝炎病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、麻風(fēng)桿菌等；②有潛在致癌性或免疫病理作用的病原體，如人類免疫缺陷病毒、單純皰疹病毒、登革病毒、呼吸道合胞病毒等；③傳統(tǒng)疫苗效果差或不良反應(yīng)大的病原體，如霍亂、百日咳等；④能簡化免疫程序、降低成本的多價(jià)疫苗，如以痘苗病毒、腺病毒、卡介苗或沙門菌屬為載體的多價(jià)活疫苗等。
基因工程疫苗只是病原體部分基因片段的產(chǎn)物，可避免使用完整病原體而可能帶來的致病性。但是，某些病原體的基因工程疫苗的抗原性不夠強(qiáng)，誘發(fā)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答水平較低，需重復(fù)接種，故仍需進(jìn)一步改進(jìn)和完善。
二、表位疫苗
表位（epitope)或抗原決定簇（antigenic determinant)是病原體中組成相對小，但具有免疫原性的短肽序列，它可誘發(fā)病原體特異性的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
T細(xì)胞表位疫苗 T細(xì)胞表位是抗原經(jīng)過抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cells，APC)加工后，由MHC分子提呈給T細(xì)胞抗原受體(Tcell receptor，TCR)的短肽�？乖８鶕�(jù)來源分為兩大類：細(xì)胞內(nèi)合成的抗原稱為內(nèi)源性抗原（endogenous antigen)，如受病毒感染細(xì)胞合成的病毒蛋白或腫瘤細(xì)胞內(nèi)合成的蛋白；來源于細(xì)胞外的抗原稱為外源性抗原（exogenousantigen)，如被吞噬的細(xì)胞或細(xì)菌。
內(nèi)源性抗原 內(nèi)源性抗原多以靶細(xì)胞作為APC。在細(xì)胞內(nèi)核糖體上合成后，轉(zhuǎn)運(yùn)到巨大多功能蛋白酶體(proteosome)降解成短肽后，經(jīng)抗原提呈相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)分子（transporterassociated with antigen processing，TAP)轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，并進(jìn)行一定的修剪，最終形成T細(xì)胞表位，進(jìn)入MHCⅠ類分子的溝槽，經(jīng)高爾基體運(yùn)送到細(xì)胞膜上，再與CD8＋CTL細(xì)胞上TCR結(jié)合，誘發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答（圖13-1)。
外源性抗原 抗原首先被APC捕獲，進(jìn)入內(nèi)體（endosome)中，再轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體中，被裂解成一系列短肽片段后，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)與MHCⅡ類分子結(jié)合，然后將抗原肽-MHCⅡ類分子復(fù)合體運(yùn)送到APC細(xì)胞膜表面，提呈給CD4＋Th細(xì)胞，激活Th細(xì)胞以輔助B細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體�；罨腡h細(xì)胞還可釋放一些細(xì)胞因子，介導(dǎo)NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答（圖13-1)。
因此，根據(jù)抗原處理和提呈過程的差異，T細(xì)胞表位疫苗可分為兩類：一類是與MHCⅡ類分子結(jié)合的CD4＋T細(xì)胞表位疫苗，另一類是與MHCⅠ類分子結(jié)合的CD8＋T細(xì)胞表位疫苗。
發(fā)展T細(xì)胞表位疫苗的關(guān)鍵在于鑒別可為T細(xì)胞與MHC分子共同識別的特異性肽段。同一種MHC分子可識別一組具有某些共同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的T細(xì)胞表位，例如，人類白細(xì)胞抗原（HLA)-A2.1限制性T細(xì)胞表位的第2位多為Leu，而第9位總是疏水性氨基酸；HLA-B27限制性T細(xì)胞表位的第2位多為Arg，其羧基端多為親水性氨基酸。這些簡單的共同結(jié)構(gòu)稱為肽模塊或基序(motif)，其氨基酸殘基是與MHC分子溝槽緊密結(jié)合的錨定殘基(anchorresidue)。如何從復(fù)雜的蛋白分子中尋找特定的肽分子，誘生高效的免疫應(yīng)答及保護(hù)性，有賴于對APC、MHC分子及微生物基因組學(xué)的深入認(rèn)識。
研制T細(xì)胞表位疫苗的方法包括：①根據(jù)MHC分子結(jié)合T細(xì)胞表位的特點(diǎn)，可對序列已知的抗原進(jìn)行T細(xì)胞表位的預(yù)測，有目的地設(shè)計(jì)和合成含有T細(xì)胞表位的短肽；②將編碼特異性抗原的微生物基因克隆到合適的表達(dá)載體，在體外進(jìn)行高效表達(dá)，以獲得抗原肽疫苗，或?qū)⒅亟M表達(dá)載體直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。
B細(xì)胞表位疫苗 由于B細(xì)胞抗原表位可與細(xì)胞膜表面直接結(jié)合，而T細(xì)胞抗原表位需經(jīng)過抗原加工與提呈，因此，B細(xì)胞表位疫苗的免疫效果要優(yōu)于T細(xì)胞表位疫苗。
多表位疫苗 是指針對同一病原體的多個(gè)抗原靶標(biāo)或多種不同病原體的多種抗原的一種新型疫苗，可對病原體生活史的不同階段或多種不同的病原體提供保護(hù)作用。精心組合的多表位疫苗可以被多種遺傳背景的MHC分子識別并結(jié)合，從而得到高效提呈。
目前，表位疫苗的研制還處于實(shí)驗(yàn)階段。研究較為成熟的表位疫苗包括HBV的PreS區(qū)第21～41aa和133～145aa、口蹄疫病毒VP1的第141～160aa片段，已分別在猩猩和豬中證實(shí)具有保護(hù)作用。
表位疫苗構(gòu)成形式單一，穩(wěn)定，不良反應(yīng)少，使用較安全，但也存在以下不足：①合成肽是一種直鏈結(jié)構(gòu)，缺乏天然蛋白的三維構(gòu)型，功能與天然蛋白不同；②半衰期短，一般只有幾分鐘，在免疫過程中易被宿主體內(nèi)蛋白酶分解；③分子量小，免疫原性較差。以上問題可通過目標(biāo)氨基酸置換及添加佐劑的辦法得以部分解決。
圖13-1 抗原提呈細(xì)胞對外源性與內(nèi)源性抗原的遞呈作用
1990年Wolff等首次意外發(fā)現(xiàn)，給小鼠肌肉注射裸露質(zhì)粒DNA后，質(zhì)粒攜帶的基因可被肌細(xì)胞攝取并在其中表達(dá)。進(jìn)一步研究證實(shí)，外源基因直接注入宿主后不僅可表達(dá)蛋白，還可誘生特異性免疫應(yīng)答。從此，核酸免疫(nucleic acid immunization)成為世界矚目的防治感染性疾病的研究熱點(diǎn)。
核酸疫苗（nucleotide vaccines)，又稱DNA疫苗，是由載體（如質(zhì)粒DNA)和編碼病原體某種有效抗原的cDNA組成，更確切的說，是將編碼某種或多種特定蛋白的基因克隆到一個(gè)真核質(zhì)粒表達(dá)載體上，然后直接注射到體內(nèi)，以期在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的蛋白，誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答。由于核酸疫苗具有構(gòu)建容易、生產(chǎn)方便、表達(dá)穩(wěn)定及可誘發(fā)全面的免疫應(yīng)答等特點(diǎn)，在抗感染、抗腫瘤免疫及疾病的預(yù)防等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，被譽(yù)為疫苗的“第三次革命”。
核酸疫苗刺激宿主免疫應(yīng)答的機(jī)制仍不十分清楚。局部注射的核酸被周圍的細(xì)胞（包括局部的組織細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞或其它炎癥細(xì)胞等)攝取后，進(jìn)入核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，并在胞質(zhì)中翻譯成目的蛋白。這些蛋白質(zhì)被蛋白酶復(fù)合體降解成含有抗原表位的短肽，其中一部分作為“內(nèi)源性抗原”，與MHCⅠ類分子結(jié)合，Ⅱ誘發(fā)較強(qiáng)的CTL細(xì)胞免疫應(yīng)答；另一部分短肽作為“外源性抗原”，與MHCⅡ類分子結(jié)合，誘發(fā)偏向Th1型免疫應(yīng)答。合成的目的蛋白亦可通過細(xì)胞分泌或細(xì)胞破裂的方式進(jìn)入組織間，以天然折疊形式激活B淋巴細(xì)胞而產(chǎn)生抗體（圖13-1)。
DNA疫苗接種后，機(jī)體內(nèi)僅表達(dá)pg～ng水平的外源蛋白，但能誘發(fā)強(qiáng)而持久的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，如何解釋這一現(xiàn)象呢？近年發(fā)現(xiàn)，如果目的基因（包括載體質(zhì)粒)含有CpG基序（motif)的回文序列，尤其是含NTCGNA或NACGTN的核心回文序列，則不但能激活較強(qiáng)的CTL效應(yīng)，還能激活巨噬細(xì)胞與NK細(xì)胞，因此，CpG回文序列被稱為免疫刺激DNA序列（immunostimulatory DNA sequence，ISS)。究其原因可能是CpG基序與IL-2、TNF-β、IFN-γ的基因結(jié)構(gòu)相似而產(chǎn)生協(xié)同作用。
核酸疫苗大多是以質(zhì)粒DNA為免疫原注射體內(nèi)，具有更加穩(wěn)定、易構(gòu)建、操作更方便及目的基因表達(dá)時(shí)間更長等特點(diǎn)。核酸免疫一般包括以下幾個(gè)過程：
1.目的基因的選擇 核酸免疫的目的主要是誘發(fā)宿主產(chǎn)生針對目的蛋白的特異性體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。目的基因的選擇側(cè)重于免疫原性，即它所表達(dá)的蛋白刺激機(jī)體免疫應(yīng)答的能力。
宿主對外來抗原能否產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答是由多方面因素決定的，其中最為關(guān)鍵的是，這些抗原分子能否被APC處理并提呈抗原，能否被MHC分子識別并形成抗原肽-MHC復(fù)合物，激活CD8＋或CD4＋T淋巴細(xì)胞，以誘生特異性的抗體或細(xì)胞毒性T細(xì)胞。因此，核酸疫苗所表達(dá)的目的蛋白中是否具有受MHC分子限制的T細(xì)胞抗原表位，是保證核酸免疫有效的先決條件。
此外，核酸疫苗所選擇的目的基因應(yīng)盡量避免有害基因成分，特別是病毒或癌基因核酸免疫。同時(shí)還要注意一些目的蛋白本身的不良反應(yīng)，以及多重核酸免疫（2個(gè)或2個(gè)以上的基因同時(shí)免疫)中不同基因之間的相互影響。為此，美國FDA明確規(guī)定，凡是用于核酸免疫的核酸，必須對其所有的結(jié)構(gòu)功能，以及多重核酸免疫各基因之間的相互作用十分清楚。
2．載體的選擇 狹義的核酸免疫并非直接注射攜帶目的基因的質(zhì)粒DNA，而是直接注射目的基因。但這種目的基因往往只是含有表達(dá)某種蛋白所必須的外顯子、內(nèi)含子和必要的調(diào)節(jié)基因，如啟動子、增強(qiáng)子以及5＇端加帽，3＇端加poly A尾等的修飾基因，它本身并不能自我復(fù)制。由于目的基因來源不同，在真核細(xì)胞中的表達(dá)效果也不同，因此有必要將目的基因克隆到一個(gè)載體上，使其能較長期地表達(dá)目的蛋白。用于制備DNA疫苗的質(zhì)粒通常是非復(fù)制型的真核表達(dá)質(zhì)粒，能高水平地表達(dá)目的基因。
用于核酸免疫目的的重組質(zhì)�？煞譃閮蓚�(gè)部分：①轉(zhuǎn)錄部分：由啟動子、插入的抗原cDNA和poly A終止子組成，指導(dǎo)目的蛋白在體內(nèi)表達(dá)，誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答；②佐劑部分：CpG基序直接刺激B細(xì)胞和單核細(xì)胞，誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞因子和APC膜上協(xié)同刺激分子的表達(dá)，產(chǎn)生針對目的蛋白的免疫應(yīng)答。人為地增加CpGDNA的用量可提高DNA疫苗的效率。
嘗試使用更有效的表達(dá)載體可提高DNA疫苗的免疫效果，如將HSV-1 gpB基因克隆于甲病毒毒株Sindbis表達(dá)載體 pSIN15和pS1N25中，單次、低劑量的重組載體免疫小鼠后，可誘發(fā)全面的免疫反應(yīng)及保護(hù)作用，原因可能是，極少量的pSIN載體進(jìn)入細(xì)胞后，復(fù)制出大量的RNA模板，并表達(dá)出高水平的外源基因產(chǎn)物，模擬自然病毒感染的特性，誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素。pSIN載體中含有常規(guī)DNA載體中不存在的病毒非結(jié)構(gòu)蛋白，能起到免疫促進(jìn)子的作用。
3．啟動子的選擇 質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源性蛋白的水平與調(diào)控DNA表達(dá)的啟動子關(guān)系密切。不同的啟動子在不同機(jī)體組織中表達(dá)的水平可以顯著不同，而表達(dá)水平的不同又直接影響免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和持續(xù)性。研究發(fā)現(xiàn)，巨細(xì)胞病毒（CMV)和呼吸道合胞病毒（RSV)的早期啟動子分別是肌肉和上皮細(xì)胞內(nèi)理想的啟動子，其它常用的啟動子還有猿猴病毒SV40、HIV長片段重復(fù)末端啟動子(LTR)、EB病毒等基因上的啟動序列，這些啟動子作用雖然較弱，但可控制外源蛋白持續(xù)低水平表達(dá)，有利于免疫應(yīng)答的長期維持。常用的poly A加尾信號為SV40及LTR。為了增加質(zhì)粒在哺乳動物細(xì)胞中的拷貝數(shù)，還常用一些不與宿主細(xì)胞基因整合的基因如EBNA1（EBV核抗原編碼基因)等，以增加目的基因的表達(dá)量。
4．DNA疫苗的優(yōu)化 為了使所表達(dá)的目的蛋白能發(fā)揮最大的免疫作用，一般可采用以下二種方式構(gòu)建：
（1)聯(lián)合構(gòu)建：在一個(gè)質(zhì)粒中同時(shí)將2個(gè)或2個(gè)以上目的基因構(gòu)建在一起，包括既能刺激CD8＋T細(xì)胞產(chǎn)生特異性CTL的抗原表位，又能刺激CD4＋T細(xì)胞產(chǎn)生體液免疫的抗原表位，因而可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)大的免疫應(yīng)答。
（2)協(xié)同構(gòu)建：將目的基因與某種細(xì)胞因子的基因構(gòu)建在一起，以促進(jìn)目的基因的免疫效果。例如，IL-4能有效作用于B淋巴細(xì)胞，是Th2型細(xì)胞分化的最強(qiáng)刺激物；IL-2、IL-12、IFN-γ等能增強(qiáng)Th1型細(xì)胞免疫；CD80（B7-1)作為一種協(xié)同刺激因子，對CD8＋CTL與CD4＋Th淋巴細(xì)胞活化均起作用，可同時(shí)加強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。
此外，可將DNA疫苗與蛋白質(zhì)疫苗聯(lián)用，可獲得更好的免疫效果。
5．免疫途徑、劑量、時(shí)間 這是最主要的影響因素，關(guān)系到核酸疫苗刺激宿主能否獲得最佳的免疫應(yīng)答效果。最常見的免疫途徑有：肌肉注射、皮內(nèi)或皮下免疫、粘膜免疫等。肌肉細(xì)胞抗原提呈能力弱，但攝取外源DNA能力強(qiáng)，生活周期長，新陳代謝較緩慢，注射的核酸可長期存在，是目前主要的免疫靶細(xì)胞。皮膚細(xì)胞的抗原提呈能力很高，但轉(zhuǎn)染效率較低，可采用基因槍皮內(nèi)接種以增強(qiáng)轉(zhuǎn)染率，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗原特異性Th1型細(xì)胞反應(yīng)，表現(xiàn)為IgG2a、IFN-γ升高。粘膜免疫除產(chǎn)生局部免疫球蛋白SIgA，在病原體入侵部位發(fā)揮特異性監(jiān)視作用外，還可誘發(fā)全身免疫應(yīng)答，對于一些經(jīng)粘膜醫(yī)學(xué)招聘網(wǎng)入侵的病原體來說，這是一種有效的免疫方法。
肌肉注射能誘導(dǎo)有效免疫應(yīng)答的DNA用量一般為16ng～400ug，免疫時(shí)間為10d～1個(gè)月�；驑岊w粒轟擊法對外源基因攝取的效率是最高的，低至16ng的核酸即可誘發(fā)有效的免疫應(yīng)答。DNA疫苗免疫應(yīng)答水平與劑量直接相關(guān)，而劑量與宿主細(xì)胞對外源性核酸攝取能力有關(guān)。
肌肉注射、皮內(nèi)或皮下接種都存在DNA攝取效率低或需要特殊設(shè)備缺點(diǎn)。另外，裸DNA在細(xì)胞質(zhì)中停留至開始轉(zhuǎn)錄，約50%～100%被降解�？梢�，如何將DNA疫苗載體高效導(dǎo)入抗原提呈細(xì)胞（APC)顯得十分重要。
胞內(nèi)菌感染宿主細(xì)胞后，可被APC吞噬殺滅，其攜帶的質(zhì)粒DNA釋放出來，進(jìn)入細(xì)胞核，使目的抗原基因得以表達(dá)。因此，可將重組減毒、代謝能力缺陷型胞內(nèi)菌（如沙門菌、志賀菌)作為DNA疫苗載體，通過粘膜自然感染途徑運(yùn)送DNA，其優(yōu)勢主要體現(xiàn)在：①減毒胞內(nèi)菌可提高質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)靶向巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞；②載體菌的某些組分可作為佐劑，增強(qiáng)DNA疫苗免疫效果；③易于生產(chǎn)，可以口服方式接種，同時(shí)激活粘膜免疫和全身免疫；④易于構(gòu)建多價(jià)疫苗。
由于有外源性基因的導(dǎo)入，核酸疫苗的安全性一直受到關(guān)注。雖然動物模型研究尚未發(fā)現(xiàn)其不良反應(yīng)，但也無足夠的證據(jù)完全排除理論上可能的危險(xiǎn)性，主要表現(xiàn)在二個(gè)方面：
1．目的抗原的長期表達(dá)以及核酸的直接注射，可能會導(dǎo)致宿主產(chǎn)生免疫耐受及抗DNA抗體或抗自身細(xì)胞的抗體。在成年動物接種DNA疫苗未見到誘導(dǎo)免疫耐受狀態(tài)，但弱抗原基因的DNA疫苗可能產(chǎn)生耐受問題。用瘧疾環(huán)狀子孢子蛋白基因接種2～5d的初生小鼠，可誘導(dǎo)特異性耐受狀態(tài)。因此，應(yīng)盡量避免選擇低表達(dá)抗原或弱免疫原性抗原。目前也尚未發(fā)現(xiàn)注射DNA疫苗的動物可產(chǎn)生抗肌細(xì)胞抗體及誘發(fā)腎小球腎炎，但有自身免疫傾向的N2/B/N2 W小鼠接種DNA后可檢測到抗雙鏈DNA抗體。
2．目的DNA有可能整合到宿主細(xì)胞基因組中，誘導(dǎo)某些癌基因的表達(dá)或抑癌基因的封閉而造成腫瘤的形成。雖然質(zhì)粒DNA在肌細(xì)胞內(nèi)持續(xù)1個(gè)月以上，但核酸免疫的劑量較小，所注射核酸中一般沒有介導(dǎo)目的基因與宿主基因整合的成分，因此，與其它基因?qū)敕ū容^，核酸疫苗相對安全。目前尚無因接種核酸疫苗引發(fā)腫瘤的報(bào)道。
核酸免疫與常規(guī)免疫的最大差異在于所使用抗原類型的不同。常規(guī)免疫所使用的抗原一般是滅活或減毒活病原體，或病原體的亞單位蛋白。核酸疫苗僅僅是病原體某種抗原的基因片段（DNA或RNA)，可提供與天然構(gòu)象極為接近的目的蛋白，提呈給宿主免疫系統(tǒng)，與自然感染過程相似，因此，核酸疫苗兼有重組亞單位疫苗的安全性和減毒活疫苗誘導(dǎo)全方位免疫應(yīng)答的高效力（表13-1)。
表13-1 常規(guī)免疫法與核酸免疫法的比較
| 比較內(nèi)容 | 減毒活疫苗 | 重組活疫苗 | 死疫苗/亞單位疫苗 | 核酸疫苗 |
| 內(nèi)源性抗原刺激CD8+ CTL 由MHC II類抗原誘導(dǎo)CD4+ Th細(xì)胞 誘導(dǎo)所有病原性蛋白免疫應(yīng)答 同種載體在不同疫苗種反復(fù)使用 載體與目的蛋白有無競爭性 對妊娠是否安全 病原基因回復(fù)突變危險(xiǎn)性 受外來抗原污染的危險(xiǎn)性 免疫力維持時(shí)間長 是否具有熱穩(wěn)定性 是否經(jīng)濟(jì)便宜 | ＋ ＋ ＋ － － － ＋ ＋ ＋ － － | ＋ ＋ ＋/－ － ＋/－ － ＋ ＋ ＋ － － | ＋/－ ＋ ＋/－ － － ＋/－ － － － ＋ － | ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋/－ － － ＋ ＋ ＋ |
常規(guī)疫苗（抗原)在血清中代謝較快，難以長時(shí)間維持較穩(wěn)定的含量，需多次加強(qiáng)接種免疫原；而核酸疫苗可在機(jī)體內(nèi)不斷翻譯表達(dá)，較長時(shí)間維持較高的蛋白水平，免疫具有連續(xù)性，一次接種可獲得長期或終身免疫力。此外，采用同種不同株之間的保守DNA序列作核酸疫苗，可使其免疫作用突破地理株的限制，從而有效地預(yù)防病原體極易發(fā)生變異的某些疾病（如丙型肝炎、甲型流感、艾滋病等)。
目前，核酸疫苗已廣泛用于抗感染、抗腫瘤免疫等研究，已有多種感染性疾�。ㄈ缫倚�病毒性肝炎、艾滋病、流感)的核酸疫苗正在進(jìn)行臨床Ⅰ、Ⅱ期試驗(yàn)，并有望在較短的時(shí)間內(nèi)投放市場。這些疾病所涉及的病原體多種多樣，所采用的動物模型從最初的小鼠發(fā)展到猩猩等靈長類動物。核酸疫苗除用于預(yù)防外，還可能對目前尚無滿意療法的某些疾�。ㄈ缏圆《拘愿窝住滩�)提供一條新的治療途徑。
獨(dú)特型（idiotypic，Id)疫苗或稱抗獨(dú)特型抗體（anti-idiotypicantibody ，AId)疫苗，是根據(jù)Jerne免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說而設(shè)計(jì)的一種新型疫苗。1974年，Jerne發(fā)表了著名的免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)學(xué)說，認(rèn)為宿主受抗原刺激后的免疫調(diào)節(jié)是通過抗體上的抗原決定簇Id和anti-Id相互反應(yīng)來進(jìn)行的。Id分子不僅存在于抗體分子上，也存在于T和B細(xì)胞表面的抗原受體上。
將某抗原(Ag)接種至動物體上，可產(chǎn)生抗體（Ab1)；再將Ab1作為抗原接種至另一動物體，可產(chǎn)生抗抗體（Ab2)。抗抗體所針對的抗原表位是抗體分子上的獨(dú)特型，故Ab2稱為抗獨(dú)特型抗體（AId)。Ab2若接種于人類，則產(chǎn)生Ab3。根據(jù)Jerne的理論，Ab1和Ab2互補(bǔ)，Ab2和Ab3互補(bǔ)，Ab3在結(jié)構(gòu)上與Ab1相似，Ab2與Ag相似，可稱為Ag的內(nèi)影像（internalimage)。Ab3應(yīng)與Ab1具有對Ag相同的免疫反應(yīng)，若Ag為某病原體的抗原，則Ab3就能對其產(chǎn)生免疫應(yīng)答（圖13-2)。利用Ab2制備的疫苗稱為獨(dú)特型疫苗，亦稱內(nèi)影像疫苗。
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抗原（Ag) Ab1
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相似
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Ab3 Ab2
圖13-2 獨(dú)特型疫苗的理論示意圖
獨(dú)特型通常是單克隆性的，即只限于某個(gè)體的一個(gè)抗體分子或一個(gè)抗體克隆所有。有的獨(dú)特型可存在于同種異體或異種個(gè)體間，是公共或交叉反應(yīng)性獨(dú)特型，這種獨(dú)特型在制備疫苗時(shí)具有重要意義。
由于獨(dú)特型疫苗是用Ab2代替Ag作為免疫原，這就避免了病原體抗原可能對宿主產(chǎn)生的毒性作用，特別適用于對付那些不宜直接對人體進(jìn)行接種的病原體。同時(shí)，為某些尚不能培養(yǎng)或產(chǎn)量很低的病原體，以及免疫原性較弱且不能用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的多糖類抗原疫苗的研制提供了另一條有效的技術(shù)路線。目前，已用于單純皰疹病毒、HIV、結(jié)核分枝桿菌、肺炎鏈球菌等病原體疫苗的研制。
轉(zhuǎn)基因植物疫苗（transgenic plantvaccine)或植物疫苗(plant-based vaccine)是指將抗原基因?qū)胫参锛?xì)胞并在其中表達(dá)，人食用已表達(dá)目的抗原的轉(zhuǎn)基因植物后，可誘發(fā)宿主產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的新型疫苗，它是20世紀(jì)90年代疫苗研究的重大發(fā)現(xiàn)之一，已嘗試用于多種重組疫苗的研制。轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)疫苗有兩種方法：一是建立整合抗原基因的穩(wěn)定表達(dá)植株，并可通過無性或有性繁殖生產(chǎn)大量的轉(zhuǎn)基因植物；二是建立瞬時(shí)表達(dá)植株，即利用基因工程植物病毒為載體，將編碼疫苗抗原決定簇基因插入植物病毒基因中，再用此重組病毒感染植物，抗原基因隨病毒在植物體內(nèi)復(fù)制、裝配而得以高效表達(dá)，可獲得高產(chǎn)量的目的蛋白，如用煙草花葉病毒作表達(dá)載體轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞，瞬時(shí)表達(dá)目的抗原。
轉(zhuǎn)基因植物作為外源蛋白的反應(yīng)器生產(chǎn)口服疫苗，具有以下顯著的優(yōu)點(diǎn)：①與動物細(xì)胞相比，植物細(xì)胞易于培養(yǎng)和進(jìn)行遺傳操作。植物細(xì)胞具有全能性，能以細(xì)胞團(tuán)、懸浮細(xì)胞或原生質(zhì)體等形式大量無限地繁殖，植物愈傷組織細(xì)胞團(tuán)和原生質(zhì)體可再生植株；②許多植物的貯藏器官，如種子胚乳、塊莖、果實(shí)等，是蛋白質(zhì)很好的聚積和保存場所，使重組蛋白的生產(chǎn)、運(yùn)輸和儲存更為容易，免疫途徑更簡便、安全；③植物細(xì)胞中的疫苗抗原通過胃內(nèi)的酸性環(huán)境時(shí)，可受到細(xì)胞壁的保護(hù)，直接到達(dá)腸內(nèi)粘膜誘導(dǎo)部位，刺激粘膜和全身免疫，比傳統(tǒng)的免疫途徑更有效；④用動物細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白，常用動物病毒做載體導(dǎo)入抗原基因，對人類有潛在的危險(xiǎn)。而植物病毒不感染人，用植物細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白更為安全；⑤轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)蛋白不需嚴(yán)格的純化程序，更為經(jīng)濟(jì)價(jià)廉，可望替代傳統(tǒng)的發(fā)酵生產(chǎn)，有利于疫苗在發(fā)展中國家的普及推廣。
可用于轉(zhuǎn)基因的植物主要集中在煙草、馬鈴薯、番茄、水稻等�？紤]到嬰幼兒的愛好問題，優(yōu)選那些嬰幼兒喜歡的植物如草莓、番茄、香蕉等來制備疫苗，則是植物疫苗能否被推廣應(yīng)用的重要因素之一。有些轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的抗原需要純化蛋白，有些則可直接經(jīng)口服免疫。
目前在植物中已成功表達(dá)乙型肝炎病毒、口蹄疫病毒、痢疾志賀菌、狂犬病病毒、流感病毒等多種抗原。在煙草中表達(dá)的HBsAg約為總可溶性抗原的0.01%，獲得了22nm的正確組裝的HBV顆粒，免疫小鼠后產(chǎn)生與重組抗原相似的免疫效果，提示轉(zhuǎn)基因植物可表達(dá)含有激發(fā)B細(xì)胞及T細(xì)胞的目的抗原的表位。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因番茄所表達(dá)的HBsAg可誘導(dǎo)特異性的B/T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答與SIgA粘膜免疫應(yīng)答。
但轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)疫苗也存在一些不足：①大多數(shù)蛋白質(zhì)疫苗表達(dá)量不高，但可通過改進(jìn)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，如采用強(qiáng)啟動子、增強(qiáng)子及調(diào)控序列來促進(jìn)表達(dá)；②口服時(shí)易被消化，可將疫苗抗原組裝成病毒樣顆粒的有序結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)抗消化作用；③有些疫苗需將目的蛋白從轉(zhuǎn)基因植物中進(jìn)行提取，以進(jìn)行人群的注射免疫，將存在如何大規(guī)模提取的問題。
我國“973”及“863”計(jì)劃都將重大疾病相關(guān)的防治措施列為重要的研究領(lǐng)域，醫(yī)用疫苗和轉(zhuǎn)基因植物研究將是我國生物技術(shù)領(lǐng)域要接近或超過國際先近水平的戰(zhàn)略重大突破口之一。盡管目前還存在轉(zhuǎn)基因植物的安全性及環(huán)境污染等方面的爭論，但該研究領(lǐng)域必然是未來國際上爭先發(fā)展的重要方向之一，也將在疫苗研究中發(fā)揮越來越重要的作用。
乳桿菌屬(lactobacillus)是革蘭陽性、無芽胞的非致病菌，多寄居于人的口腔、消化道和陰道內(nèi)。在人排泄物中已發(fā)現(xiàn)3種乳桿菌：嗜酸乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和唾液乳桿菌，在食品發(fā)酵過程中有重要作用，如酸奶的制作。近年發(fā)現(xiàn)，乳桿菌攜帶許多隱秘的質(zhì)粒，這為在乳桿菌中進(jìn)行基因操作提供了條件。
沙門菌作為外源蛋白的載體已廣為人知，但它一般不能分泌表達(dá)蛋白質(zhì)，而多數(shù)乳桿菌則可分泌蛋白，如酸素A（acidocin A)，因此可作為分泌型表達(dá)載體，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的特異性免疫應(yīng)答，特別是局部粘膜免疫應(yīng)答。
與大腸埃希菌相比，人們對乳桿菌的遺傳背景還缺乏足夠的認(rèn)識，但乳桿菌作為口服疫苗有三個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)：價(jià)廉、安全和方便，因此，有充分的理由相信乳桿菌能成為一個(gè)理想的口服活菌疫苗，直接通過口服酸奶等食物獲得免疫效果。1986年，首次證實(shí)嗜酸乳桿菌可有效地提高小鼠對沙門菌引起的腸道感染的抵抗力，從而奠定了乳桿菌屬作為一種高效的口服疫苗載體系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)。
利用非致病性的德氏乳桿菌乳亞種（Lactobacillus lactis)作為粘膜免疫的抗原提呈系統(tǒng)，使其能在體外大量表達(dá)破傷風(fēng)痙攣毒素C片段(TTFC)，口服免疫后，能激發(fā)保護(hù)性的血清抗體反應(yīng)，并在粘膜部位產(chǎn)生TTFC特異性的IgA�？诜鼙磉_(dá)炭疽芽胞桿菌保護(hù)性抗原的干酪乳桿菌（Lactobacilluscasei)，不僅能引起系統(tǒng)的免疫反應(yīng)，還能產(chǎn)生SIgA抗體的局部粘膜免疫，可用于防治炭疽病。重組乳桿菌亦可用于治療胃潰瘍、陰道炎等疾病，并獲得較好的免疫保護(hù)效果。乳桿菌本身可單獨(dú)作為微生態(tài)制劑，對病原微生物具有拮抗作用，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。
此外，從乳桿菌中提取拷貝數(shù)高、分子量小的質(zhì)粒，構(gòu)建高表達(dá)的分泌載體。用此克隆系統(tǒng)，將外源基因，如某些營養(yǎng)物質(zhì)（各種必需氨基酸、維生素)、藥物（如抗癌藥物、防衰老藥物)、生長發(fā)育的激素等基因?qū)肴闂U菌中，制成活菌制劑，引入人體內(nèi)，產(chǎn)生機(jī)體所需的外源基因的產(chǎn)物，既可加強(qiáng)營養(yǎng)，又可防病治病。
早在20世紀(jì)初期，Wright等嘗試采用滅活疫苗治療慢性細(xì)菌性疾病，如葡萄球菌性皮膚病和慢性淋病，取得較好的效果。但是，隨著抗生素的問世和迅速發(fā)展，治療性疫苗(therapeuticvaccine)用于傳染病的治療進(jìn)入低潮。近年來，由于對病原微生物的致病機(jī)制和機(jī)體抗感染免疫應(yīng)答的認(rèn)識不斷加深，微生物持續(xù)性感染日趨嚴(yán)重，治療性疫苗重新成為研究的熱點(diǎn)，尤其是針對無理想抗微生物藥物或易產(chǎn)生耐藥性的微生物感染。
預(yù)防性疫苗的接種對象是健康人群，其研制多采用模擬自然感染過程的策略，一般為微生物的保護(hù)性抗原，成分較單純，主要用于免疫預(yù)防作用，對機(jī)體無明顯的病理損傷，使用安全可靠，已在世界范圍內(nèi)廣泛用于傳染病的預(yù)防接種，成功地用于預(yù)防病原體進(jìn)化相對保守、自然感染可獲得牢固免疫力、保護(hù)性免疫主要依賴于中和抗體的疾病，如天花、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹等。
但是，在自然感染不能誘發(fā)長時(shí)間免疫力而且引起慢性持續(xù)性感染的疾病中，模擬自然感染過程的策略難以研制出高效疫苗，原因一方面是細(xì)胞免疫比體液免疫更為重要；另一方面部分病原體可通過其不合理的表位或免疫缺陷，加重感染過程和病理過程；病原體（或抗原)含有與各種不同的細(xì)胞因子或補(bǔ)體等高度同源性序列，從而干擾細(xì)胞間通訊，產(chǎn)生免疫顛覆（immune subvertion)，因而病原體可逃避宿主的免疫清除而處于病原攜帶狀態(tài)或持續(xù)性感染狀態(tài)。
治療性疫苗的接種對象是持續(xù)性感染患者或帶菌者，其組分不像預(yù)防性疫苗那樣單純，可根據(jù)需要進(jìn)行組合和調(diào)整，如用微生物抗原基因與不同細(xì)胞因子基因組成并表達(dá)的嵌合性疫苗。治療性疫苗旨在啟動Th1極化和有效的細(xì)胞免疫，打破機(jī)體的免疫耐受，提高對病原體特異性免疫應(yīng)答水平，故特別強(qiáng)調(diào)佐劑的選用。由于治療性疫苗屬于免疫治療，可能伴有免疫損傷，有一定的不良反應(yīng)。
治療性疫苗分為特異性及非特異性疫苗兩種。卡介苗屬于非特異性疫苗，可刺激T/B細(xì)胞增殖，激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞，從而發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用，協(xié)助藥物清除病原微生物�？ń槊缫嗫勺鳛槟[瘤的輔助治療用藥，可增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。
但大多數(shù)特異性治療性疫苗的作用機(jī)制目前還不甚清楚。疫苗療法的反對者不相信疫苗能改善天然免疫應(yīng)答，因?yàn)榛颊唧w內(nèi)已存在大量的微生物抗原，免疫系統(tǒng)已盡全力，尚不能消滅入侵者，再給機(jī)體注入抗原，根本發(fā)揮不了作用。最合理的辦法是用藥物直接攻擊入侵的病原體。
但是，支持者認(rèn)為，治療性疫苗的作用不同于患者體內(nèi)的微生物抗原，它通常是由大劑量高度純化的微生物抗原和提高免疫功能的其它成分組成，抗原量大，免疫原性強(qiáng)，可通過不同的途徑將微生物抗原提呈給免疫系統(tǒng)，能更有效地誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答，打破免疫耐受狀態(tài)，部分糾正機(jī)體的免疫缺陷，達(dá)到清除病原體的目的。例如，對于麻風(fēng)、結(jié)核及病毒等胞內(nèi)寄生微生物，由于機(jī)體不能有效地誘發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答而導(dǎo)致持續(xù)感染，治療性疫苗則可改善患者的免疫狀態(tài)，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，達(dá)到清除病原體、防止復(fù)發(fā)的目的。
三、研制策略
設(shè)計(jì)治療性疫苗的抗原時(shí)，可考慮用模擬抗原（mimogen)代替天然抗原，從而克服機(jī)體對天然抗原的耐受性，同時(shí)選用合適的佐劑。主要策略有：
打破免疫耐受 研究發(fā)現(xiàn)，用HBsAg制成的治療性疫苗可引起抗原提呈細(xì)胞提呈抗原，表達(dá)協(xié)同刺激分子，誘發(fā)特異性CTL細(xì)胞反應(yīng)，從而打破免疫耐受，使相當(dāng)一部分患者體內(nèi)病毒復(fù)制停止或消失，達(dá)到治療目的。
據(jù)報(bào)道，對46例HBsAg及HBV DNA陽性的慢性乙型肝炎患者注射3劑HBV疫苗，每月1次，半年后，12例患者HBV DNA陰轉(zhuǎn)，另8例HBVDNA水平顯著下降。用IFN治療12例應(yīng)答者中的6例，4月后HBV DNA仍為陰性；34例無應(yīng)答患者中的20例給予IFN治療，2例給予阿糖腺苷，結(jié)果12例HBVDNA陰轉(zhuǎn)，可見，在抗病毒藥物治療前給予HBV 疫苗，對大幅度降低HBV DNA水平，為乙型肝炎的治療提供一條價(jià)廉、高效、安全的途徑。
研究證實(shí)，HBV DNA疫苗與IL-2、IL-12和GM-CSF等細(xì)胞因子基因聯(lián)合注射后，可誘發(fā)強(qiáng)烈的Th1型免疫應(yīng)答，CTL活性增強(qiáng)。治療性HBV疫苗可在CTL水平打破HBV感染后的免疫耐受。我國學(xué)者已開展乙肝疫苗聯(lián)合豬苓多糖、人抗-HBsIgG、干擾素、胸腺素等治療慢性乙型肝炎，獲得了較好的效果，療效比單獨(dú)用藥好。
引起保護(hù)性免疫應(yīng)答 很多慢性感染中自然感染后產(chǎn)生的免疫應(yīng)答往往為非保護(hù)性，如幽門螺桿菌（Hp)主要誘發(fā)Th1型細(xì)胞免疫，產(chǎn)生大量IFN-γ（參見第9章)。IFN-γ對胞內(nèi)菌感染的清除非常重要。但是，由于免疫細(xì)胞難以接近Hp感染的胃粘膜上皮細(xì)胞，故IFN-γ不能清除胞外菌Hp，反而造成組織損傷。采用減毒沙門菌為載體，表達(dá)Hp尿素酶B亞單位，制成活載體疫苗，口服后能引發(fā)強(qiáng)烈的Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答，而不加重組織損傷，達(dá)到治療目的。
在控制胞內(nèi)菌感染上，與Th1型細(xì)胞相關(guān)的CTL和IFN-γ非常重要。DNA疫苗、活載體疫苗或減毒活疫苗可誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫，誘發(fā)CTL產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答，因此可作為治療性疫苗。
通過表達(dá)人乳頭瘤病毒（HPV)的 L1E7 融合蛋白，制備一種嵌合的病毒樣顆粒（virus-like particle, VLP)，免疫動物后可誘發(fā)針對L1樣顆粒的中和抗體應(yīng)答及E7特異性T細(xì)胞應(yīng)答，表明VLP疫苗適于治療HPV感染。
由于目前很多傳染�。ㄈ鏗IV、HCV、HBV感染等)、腫瘤等尚無有效的治療藥物，而治療性疫苗的不良反應(yīng)比化療藥物少，因此，治療性疫苗與藥物治療可協(xié)同作用，提高機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答水平，加速康復(fù)，減少復(fù)發(fā)。治療性疫苗已在乙型肝炎、艾滋病、麻風(fēng)、結(jié)核、布魯菌病、皰疹等疾病的治療中發(fā)揮了f1411.cn一定作用。
疫苗研制屬于高技術(shù)生物藥物開發(fā)范疇。FDA的報(bào)告顯示，疫苗增長非常迅速，年增加品種達(dá)到44%，分別用于癌癥、艾滋病、乙型肝炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、帕金森征等疾病的治療。國外權(quán)威專家預(yù)測，未來的生物技術(shù)重磅炸彈生物藥品將由5類組成：單克隆抗體、反義核酸、基因治療藥物、可溶性蛋白質(zhì)類藥物、疫苗（特別是治療性疫苗)。可見，治療性疫苗具有廣闊的發(fā)展前景，但對其安全性必須予以高度重視。
早期對疫苗佐劑的認(rèn)識僅限于佐劑可提高特異性抗體的水平，研究的著眼點(diǎn)放在B淋巴細(xì)胞系統(tǒng)，將能與抗原結(jié)合并非特異性地增強(qiáng)抗體應(yīng)答的物質(zhì)稱為佐劑（adjuvant)。但是，隨著對免疫佐劑作用機(jī)制、免疫細(xì)胞及免疫活性分子的深入了解，發(fā)現(xiàn)除體液免疫（B細(xì)胞系統(tǒng))外，細(xì)胞免疫（T細(xì)胞系統(tǒng))在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答方面也有非常重要的作用。例如，Th細(xì)胞能識別與MHCⅡ類分子相關(guān)的抗原決定簇，涉及對宿主細(xì)胞中不能合成的抗原（如大多數(shù)細(xì)菌抗原)的免疫應(yīng)答；Tc細(xì)胞能識別與MHCⅠ類分子相關(guān)的抗原決定簇，涉及對宿主細(xì)胞合成的抗原（如病毒某些抗原)的免疫應(yīng)答。
因此，理想的免疫佐劑除了可刺激B細(xì)胞產(chǎn)生能直接識別外來抗原的抗體外，尚要求能調(diào)動T細(xì)胞系統(tǒng)的功能。佐劑可定義為：能調(diào)動整個(gè)免疫系統(tǒng)的功能，非特異性地作用于抗原而增強(qiáng)或延長其特異免疫原性的物質(zhì)。
近年來，人們大量使用生物合成、基因重組及其它手段制備的純化亞單位疫苗或合成疫苗，但這些疫苗的免疫原性很弱，需要佐劑的幫助才能有效地誘發(fā)高水平免疫應(yīng)答。傳統(tǒng)的佐劑如氫氧化鋁具有很多本身無法克服的缺陷，如使用后發(fā)生炎癥反應(yīng)等，促使人們研制新的佐劑系統(tǒng)。目前，佐劑在提高機(jī)體抗病毒免疫、抗腫瘤免疫、保持免疫網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定方面的作用日益受到關(guān)注。
免疫調(diào)節(jié)作用 主要指佐劑調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的能力，可上調(diào)或下調(diào)某些細(xì)胞因子的表達(dá)。此類佐劑與免疫原分開注射也有效。人與小鼠的CD4＋Th細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)刺激后，分化成Th1和Th2兩個(gè)亞群。前者偏向于分泌IL-2、IL-12和IFN-γ，可促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和B細(xì)胞產(chǎn)生小鼠IgG2a（相當(dāng)于人IgG1)抗體；后者偏向于分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生高濃度的IgG1和IgE抗體，增強(qiáng)抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。目前，衡量佐劑的效能不再只看所誘生抗體的總水平，而需看誘生抗體的質(zhì)量，即抗體的亞類和親和力。
佐劑免疫調(diào)節(jié)作用還可通過改變抗原的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)重組、表位暴露等（如脂質(zhì)體)，活化補(bǔ)體（如葡聚糖)，誘導(dǎo)粘附分子、輔助刺激因子、結(jié)合蛋白等免疫生物活性分子的表達(dá)（如多糖)，誘導(dǎo) T及B淋巴細(xì)胞的免疫記憶（如CT、CT-B、脂質(zhì)體)。
提呈作用及靶向作用 佐劑通過刺激單核-巨噬細(xì)胞，增加對抗原的處理和提呈能力�？乖岢始�(xì)胞(APC)主要是樹突狀細(xì)胞(dentritic cells，DC)、巨噬細(xì)胞(Mφ)及B細(xì)胞等。佐劑刺激APC表達(dá)IL-l，后者吸引CD4＋T細(xì)胞移向APC，T細(xì)胞受體（TCR)與抗原肽-MHC復(fù)合物互補(bǔ)結(jié)合，可促進(jìn)T細(xì)胞的克隆增殖，此階段可能發(fā)生Th1／Th2型免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)變。選擇靶向Mφ還是DC，所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答類型將有實(shí)質(zhì)性變化。最新研究表明，缺乏Mφ將使應(yīng)答轉(zhuǎn)向Th2型。
目前認(rèn)為，B細(xì)胞SIg識別抗原的構(gòu)象決定簇，T細(xì)胞識別結(jié)合在MHC分子上的短肽，因此，有效的疫苗需要保持決定簇的構(gòu)象，應(yīng)選用非變性佐劑如Syntexadjuvant formation(SAF)。而氫氧化鋁佐劑會導(dǎo)致抗原變性而喪失構(gòu)象，弗氏（Freund )佐劑乳化的抗原所誘導(dǎo)的抗體一般只識別抗原內(nèi)部決定簇而非構(gòu)象決定簇。
誘導(dǎo)CD8＋CTL應(yīng)答 誘導(dǎo)CTL的佐劑應(yīng)能促進(jìn)多肽與MHCⅠ類分子結(jié)合。最有效方法是使佐劑與APC膜發(fā)生反應(yīng)，在膜融合時(shí)將與佐劑結(jié)合的抗原貯存于細(xì)胞質(zhì)中，誘導(dǎo)IFN-γ表達(dá)，以提高抗原肽-MHCⅠ類分子水平。誘導(dǎo)CTL的另一機(jī)制是CTL識別的肽直接結(jié)合到空的、外露的MHCⅠ類分子。
抗原儲存作用 短期貯存的佐劑有鋁鹽和油包水乳劑，注射8～10d后切除注射部位，對應(yīng)答強(qiáng)度和持久性無影響，提示此時(shí)抗原已被清除或屏蔽。長期儲存則提供持續(xù)和脈沖式抗原釋放，最好的是合成多聚體微球，直徑≥10μm，其包含成分(免疫原和佐劑)可存留于注射部位直到被APC生物降解清除，釋放時(shí)間為1～6個(gè)月。
改變抗原分子的物理性狀 根據(jù)抗原分子物理性狀不同，可將其分為可溶性和顆粒性抗原。通常顆粒性抗原更有利于APC的內(nèi)吞及吞噬，穩(wěn)定性較好。T細(xì)胞免疫佐劑可改變抗原分子的物理性狀或增加其分子量、或變可溶性抗原為顆粒性抗原或形成抗原微庫(antigenmicroreservoir)。
表位外顯及空間限構(gòu)抗原分子的易接近性(accessibility)是決定該抗原分子免疫原性強(qiáng)弱的重要因素之一。天然蛋白抗原由于存在空間障礙(stereohindrance)，許多有效的抗原表位不能外露，易接近性較差�；蚬こ痰陌l(fā)展及人工合成肽技術(shù)的應(yīng)用，使人們可能有目的地表達(dá)或合成某一抗原表位。然而，如何外顯這些表位，避免其相互集聚形成新的空間障礙十分重要。T細(xì)胞免疫佐劑增強(qiáng)抗原免疫原性的一個(gè)重要機(jī)制就是使抗原表位外顯。
佐劑一般可分為：①顆粒型佐劑：包括鋁鹽、油包水乳劑、水包油乳劑、免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)、脂質(zhì)體、納米和微米顆粒、鈣鹽、蛋白體、病毒體等；②非顆粒型佐劑：包括胞壁酰二肽(MDP)及衍生物、皂苷、脂質(zhì)A、細(xì)胞因子、糖類聚合體、多糖衍生物、細(xì)菌毒素等。
（一)多糖佐劑
免疫原性較弱的抗原往往是病原體的多糖抗原，一般包括菌體多糖和莢膜多糖。研究證實(shí)，許多細(xì)菌的多糖抗原均為保護(hù)性抗原，如B型流感嗜血桿菌莢膜多糖、傷寒沙門菌的Vi抗原、銅綠假單胞菌菌體多糖等。這類抗原均屬于T細(xì)胞不依賴型抗原（Ti-Ag)，在宿主的免疫應(yīng)答中僅產(chǎn)生IgM，無記憶B細(xì)胞形成，不產(chǎn)生加強(qiáng)應(yīng)答，因此，免疫原性弱，須和蛋白質(zhì)結(jié)合加強(qiáng)其免疫原性，才能達(dá)到理想的免疫效果。將免疫原性弱的抗原與免疫原性強(qiáng)的抗原結(jié)合而成的疫苗稱為結(jié)合或偶聯(lián)疫苗（conjugatevaccine)。
在設(shè)計(jì)和制備結(jié)合疫苗時(shí)應(yīng)考慮以下因素：①多糖抗原的選擇，依據(jù)細(xì)菌的保護(hù)性抗原是莢膜多糖還是菌體多糖而定；②多糖分子的大小，選擇天然多糖或經(jīng)降解后的寡多糖；③載體蛋白的選擇；④結(jié)合方式，2個(gè)抗原可采用直接結(jié)合或通過化學(xué)聯(lián)結(jié)劑結(jié)合等。結(jié)合疫苗中二種抗原經(jīng)化學(xué)共價(jià)鍵結(jié)合后，免疫原性均得到增強(qiáng)，不僅起到聯(lián)合接種的目的，還同時(shí)提高了免疫接種效果，特別是在兒童中免疫接種效果尤為顯著，已成為兒童疫苗研制的一個(gè)熱點(diǎn)，其中最成功的結(jié)合疫苗是流感嗜血桿菌莢膜多糖結(jié)合疫苗。
作為一種可供人用的有效疫苗，必須具備二大特性：①結(jié)構(gòu)特性：包括多糖抗原和載體蛋白之間以化學(xué)共價(jià)鍵牢固地結(jié)合；多糖分子大小及其與載體蛋白的結(jié)合比例，有利于刺激宿主產(chǎn)生最強(qiáng)的針對多糖的免疫應(yīng)答；重復(fù)制備性及穩(wěn)定性好，有效期較長；易于標(biāo)準(zhǔn)化；②功能特性：包括無毒、安全；不引起宿主產(chǎn)生超敏反應(yīng)和組織排斥反應(yīng)；注射宿主后能同時(shí)誘發(fā)細(xì)胞免疫與體液免疫等。
（二)聚合物佐劑
理想的疫苗除了免疫效果良好、制作工藝簡便外，最好單次免疫后能提供完全、長期的保護(hù)作用，以降低疫苗制備成本和接種費(fèi)用，易于推廣應(yīng)用。但是，目前所用的疫苗需再次或多次接種來加強(qiáng)免疫效果，不利于疫苗在發(fā)展中國家、城市暫住人口及農(nóng)村地區(qū)的兒童中推廣。最有效的解決辦法是，發(fā)展一次免疫就能達(dá)到長期保護(hù)作用的單針疫苗。
單針疫苗實(shí)際上是一種能控制免疫原定期釋放而模擬反復(fù)免疫的一種新型疫苗，其本質(zhì)是對常規(guī)疫苗進(jìn)行加工，使之進(jìn)入宿主后能長期穩(wěn)定地釋放免疫原，達(dá)到多次免疫的目的。
目前，脂質(zhì)體、單層囊、乳劑及聚合物都可作為單針疫苗的佐劑，其中以聚合物（polymer)最具開發(fā)價(jià)值。最常用的聚合物有聚乳酸乙醇酸(PLGA)、丙烯酸聚合物、聚氰基丙烯酸酯(PACA)等，其中PLGA是一種可注射的生物降解聚合物，也是唯一獲得FDA批準(zhǔn)使用的人工合成生物降解聚合物。它具有疏水性和淋巴定向性，非酶性水解，可通過改變其分子量或單體構(gòu)成比例調(diào)整其緩釋來控制免疫效果。
以聚合物包裹疫苗抗原而制備的單針疫苗又稱為微囊疫苗（microcapsulizedvaccine)，亦稱可控緩釋疫苗（controlled slow release vaccine)。在制備時(shí)利用有機(jī)溶劑將PLGA-抗原-有機(jī)溶劑溶液與水或硅油中的乳化劑混合，使抗原包裹于PLGA微球中，干燥去除殘余有機(jī)溶劑后，以干粉形式儲存。當(dāng)干燥微球再水化時(shí)，微球表面及附近的抗原就可以擴(kuò)散到微球周圍的介質(zhì)或組織中，隨后抗原繼續(xù)擴(kuò)散出微球（持續(xù)釋放)，或因缺乏抗原擴(kuò)散孔或通道而進(jìn)入滯留期（脈沖釋放)。一段時(shí)間后，水催化PLGA的酯水解，形成大量抗原擴(kuò)散孔并進(jìn)入第二次擴(kuò)散期，從而達(dá)到抗原持續(xù)釋放或脈沖釋放的目的。據(jù)報(bào)道，通過調(diào)整PLGA的制備方法及疫苗抗原的含量，可以使兩次抗原擴(kuò)散時(shí)間間隔達(dá)1～6個(gè)月。一般認(rèn)為，以口服微囊疫苗的免疫效果較好。
據(jù)國外報(bào)道，將HIV-1的gp120制成微囊疫苗，接種動物后產(chǎn)生的病毒中和抗體應(yīng)答，與gp120亞單位疫苗反復(fù)免疫的效果相似，一次接種后誘生的中和抗體應(yīng)答可持續(xù)1年。瘧疾傳播阻斷抗原(TBV25H)疫苗用常規(guī)明礬作為佐劑，免疫3次后仍不能誘生完全保護(hù)，而用TBV 25H PLGA微囊疫苗免疫1次，在抗原脈沖釋放約40d后就可誘導(dǎo)完全保護(hù)。
單針疫苗具有許多常規(guī)疫苗所沒有的特點(diǎn)，但仍需不斷完善，例如，包裹抗原的量與微囊大小的最佳比例，微粒制備方法不同對抗原釋放的影響，抗原的長期釋放可能導(dǎo)致的免疫耐受，微囊疫苗在體內(nèi)生理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性，人用微囊的無菌處理以及局部注射可能造成的局部炎癥反應(yīng)等。不過，單針疫苗作為一種新型疫苗，將有望替代現(xiàn)有反復(fù)免疫的疫苗。
（三)細(xì)菌毒素佐劑
霍亂腸毒素（CT)、大腸埃希菌不耐熱腸毒素（LT)已被廣泛用作口服疫苗的粘膜佐劑。
超抗原（superantigen, SAg)是一類特殊的抗原，是功能異�；钴S的蛋白質(zhì)分子（參見第3章)。與普通抗原相比，它具有以下特點(diǎn)：①不需要抗原提呈細(xì)胞加工提呈，可直接與MHCⅡ類分子結(jié)合形成復(fù)合體，進(jìn)一步與TCRVβ區(qū)結(jié)合形成三聚體，并激活多克隆T細(xì)胞。SAg能非特異激活大量T細(xì)胞，它不遵循傳統(tǒng)的抗原提呈途徑，不同SAg結(jié)合的MHCⅡ類分子的獨(dú)特型及親和力不同；②SAg對T細(xì)胞的激活頻率高達(dá)5%～30%，比普通抗原高103～105倍，因此極微量的超抗原（pMol數(shù)量級)就能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答；③能同時(shí)激活CD4+T和CD8+T細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。
根據(jù)SAg和TCR、MHCⅡ類分子作用的分子機(jī)制，有人提出超抗原疫苗（Superantigenvaccine)的新思路，即通過誘變或修飾超抗原分子，降低其與MHCⅡ類分子和TCR Vβ區(qū)的親和力，使其失去超抗原的毒性作用，但能誘導(dǎo)具有天然超抗原特異性的保護(hù)性抗體，可結(jié)合天然超抗原，用于防治超抗原介導(dǎo)和引起的疾病。
尋找理想的減毒突變體和采用合適的體內(nèi)外模型評價(jià)SAg毒性是超抗原疫苗研究的關(guān)鍵。細(xì)菌外毒素因作用機(jī)制相對簡單，已成為SAg疫苗研究的主要對象，例如，通過位點(diǎn)定向誘變獲得一系列與TCR或MHCⅡ結(jié)合減弱的鏈球菌致熱外毒素A（SEA)突變體，均誘導(dǎo)出高水平的抗SEA抗體，用天然SEA攻擊后，免疫動物可獲得保護(hù)。
盡管對超抗原疫苗的研究還處于起步階段，但其特殊的免疫學(xué)特性必將為AIDS、腫瘤和自身免疫病等人類頑固性疾病的防治開辟一條新途徑。
（四)免疫球蛋白佐劑
雙特異抗體(bispecific antibody，BsAb)，又稱雙功能抗體，是指抗體分子表面具有兩個(gè)不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)，可同時(shí)與兩種不同的抗原結(jié)合。傳統(tǒng)意義上的抗體是單特異的，只能與一種抗原結(jié)合，具有單特異雙價(jià)的特征，而BsAb是雙特異單價(jià)抗體。BsAb在體內(nèi)導(dǎo)向（抗腫瘤藥物、毒素、放射性核素、抗原等)及體外免疫組化、免疫化學(xué)分析中均有廣闊的應(yīng)用前景。
用 BsAb定向運(yùn)送抗原至 APC，增強(qiáng)抗原免疫原性及抗體應(yīng)答反應(yīng)的機(jī)制尚不十分清楚，可能是：抗體能夠聚合濃縮抗原，在聚合狀態(tài)下，抗原決定簇(表位 )更集中；被抗體聚合成團(tuán)的抗原較可溶性抗原更易被吞噬細(xì)胞吞噬，有利于抗原的加工處理。雙特異抗體作為一種很好的抗原定向運(yùn)送系統(tǒng)，避免了佐劑無法克服的炎性反應(yīng)等不良反應(yīng)，且能極大地增強(qiáng)抗原的免疫原性及抗體應(yīng)答水平，為今后疫苗佐劑的研究提供了一條新思路。
（五)CpG DNA佐劑
CpG特征結(jié)構(gòu)是以非甲基化胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸（CpG)為基序（motif)的回文序列，5＇端為2個(gè)嘌呤，3＇端為2個(gè)嘧啶，即一般遵循5′-PuPuCGPyPy-3′方式。CpG序列可激活多種免疫效應(yīng)細(xì)胞，故又稱為免疫刺激DNA序列（immun-stimulatoryDNA sequence, ISS)。
CpG島在細(xì)菌、病毒基因組中含量較高，而在脊椎動物DNA中出現(xiàn)頻率僅為細(xì)菌的1/4，并且80%以上CpG的胞嘧啶高度甲基化。這種顯著差異可能是使CpG基序成為免疫刺激信號的基礎(chǔ)，提示在長期進(jìn)化過程中，動物機(jī)體可能形成一種通過識別非甲基化CpG基序來防御病原微生物感染的免疫機(jī)制。不過，單純的CpG基序不足以激活免疫細(xì)胞，其側(cè)翼序列也是不可缺少的。
含有CpG基序的DNA片段是一種強(qiáng)烈的非特異性免疫刺激劑，可作用于多種免疫細(xì)胞。研究表明，CpGDNA可能經(jīng)吸附內(nèi)吞作用，被B細(xì)胞或單核細(xì)胞攝取，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)酸性空間，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧成分（reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生。ROS作為一種細(xì)胞內(nèi)第二信使，引起IκB等因子的磷酸化及降解，激活NF-κB�；罨腘F-κB介導(dǎo)調(diào)控多種細(xì)胞因子的表達(dá)，從而發(fā)揮多種免疫效應(yīng)（參見第4章)。
CpG DNA可直接激活B細(xì)胞，IL-6 mRNA含量明顯增加，呈全身系統(tǒng)性分泌，而IL-6在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，CpGDNA可直接激活B細(xì)胞和單核細(xì)胞（包括巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)，上調(diào)細(xì)胞表面MHCⅡ類分子和協(xié)同刺激因子（如CD80、CD86)的表達(dá)，分泌Th1型細(xì)胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-12等，但無IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等產(chǎn)生，提示CpGDNA主要誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答，或調(diào)節(jié)Th2型免疫應(yīng)答向Th1型轉(zhuǎn)變。此外，CpG DNA在單核細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子作用下，可提高T細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性反應(yīng)。
Th1型免疫應(yīng)答能增強(qiáng)宿主對微生物感染（尤其是胞內(nèi)病原體)的免疫應(yīng)答和防御功能，而Th2型應(yīng)答則與感染的進(jìn)展、持續(xù)性和慢性化有關(guān)。弗氏佐劑可產(chǎn)生強(qiáng)Th1型免疫應(yīng)答，但不良反應(yīng)使之僅局限于動物疫苗。鋁化合物佐劑是目前唯一允許用于人體的佐劑，但主要誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答而不是Th1型。CpGDNA能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗體應(yīng)答和Th1型細(xì)胞免疫，因此，有望成為應(yīng)用于人體的新型佐劑，其主要用途有：
1．抗微生物感染疫苗制備：常規(guī)的蛋白質(zhì)疫苗和死疫苗作為外源性抗原被免疫系統(tǒng)處理后，由于缺乏MHCⅠ類分子提呈，不能誘導(dǎo)CTL反應(yīng)。CpGDNA和蛋白質(zhì)抗原共同免疫動物后，可誘發(fā)強(qiáng)烈的Th1型細(xì)胞因子和CTL反應(yīng)。將CpG DNA插入載體內(nèi)部或外源性與DNA疫苗共注射，均可增強(qiáng)疫苗免疫原性，提高抗體免疫應(yīng)答水平。例如，在HBVDNA疫苗中加入CpG DNA，可大大加速血清抗原陰轉(zhuǎn)，提高抗體效價(jià)。CpG DNA亦是流感疫苗的有效的粘膜免疫佐劑。
2．腫瘤免疫治療：CpG DNA能激活NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并誘生多種細(xì)胞因子如INF-γ，提高ADCC作用，從而抑制腫瘤的生長，是腫瘤疫苗的有效佐劑。用IL-2和抗腫瘤單克隆抗體重復(fù)注射腫瘤小鼠，存活率只有40%；而協(xié)同使用CpGDNA及抗腫瘤的單克隆抗體后，小鼠存活時(shí)間顯著延長，存活率也大大提高。此外，CpG DNA的佐劑效果與GM-CSF有很強(qiáng)的協(xié)同作用，可誘發(fā)強(qiáng)烈的Th1型免疫應(yīng)答。
3．阻止變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生：過敏反應(yīng)及其相關(guān)疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病、哮喘等與Th2型免疫應(yīng)答密切相關(guān)。CpGDNA為過敏性疾病的治療開辟了新前景，它能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的抗原特異性Th1型反應(yīng)，抑制Th2型反應(yīng)，降低IgE的合成及嗜酸細(xì)胞的活化。研究發(fā)現(xiàn)，將CpGDNA與抗原同時(shí)飼喂對此抗原已致敏的小鼠，結(jié)果CpG DNA通過將免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變?yōu)門h1型而消除了以Th2型細(xì)胞因子為特征的變態(tài)反應(yīng)。CpG DNA提前注射比與過敏性抗原同時(shí)注射效果更好。
總之，CpG DNA增強(qiáng)免疫活性的發(fā)現(xiàn)拓展了人們對DNA生物學(xué)功能的認(rèn)識。隨著對其免疫作用機(jī)制逐步深入的研究，將有望獲得一種安全高效的人用的新型疫苗佐劑。
（六)脂類分子內(nèi)佐劑
脂類分子內(nèi)佐劑分子的基本構(gòu)想是：在抗原肽的末端共價(jià)連接一脂類集團(tuán)，形成穩(wěn)定的脂肽分子—脂肽疫苗，免疫原性得以提高，在體內(nèi)有效地誘發(fā)抗原特異性免疫應(yīng)答。脂肽分子在水溶液表面形成粘滯性單層分子，其脂鏈迅速與脂膜結(jié)合，以脂質(zhì)為載體通過跨膜作用或肽抗原識別膜受體作用，將抗原肽導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)入抗原提呈途徑，快速發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。
最早使用的分子內(nèi)佐劑為人工合成的三棕櫚酰絲氨酰甘油基半胱氨酸（P3CSS)，它有良好佐劑性，可與抗原肽共價(jià)連接。α-氨基十六烷酸亦可作為分子內(nèi)佐劑，可與HIV-1gp160包膜蛋白的CTL表位肽共價(jià)連接，無需其它物質(zhì)配合使用，即可刺激Th細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)CTL反應(yīng)。脂質(zhì)體是由磷脂雙層構(gòu)成的具有水相內(nèi)核的脂質(zhì)微囊，具有無毒、無免疫原性、易于被組織吸收、可被生物降解的特點(diǎn)，是一種多功能載體。脂質(zhì)體作為疫苗佐劑，可保護(hù)DNA疫苗免受核酸酶降解，將目的基因DNA特異傳遞到靶細(xì)胞中，可同時(shí)增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫。
目前，脂類分子內(nèi)佐劑已成為免疫學(xué)研究，特別是在B、T細(xì)胞表位圖譜測定、抗病毒感染等有效工具，除高效、安全、耐受好、成本低等優(yōu)點(diǎn)外，還具有以下特點(diǎn)：①佐劑為大腸埃希菌天然免疫活性蛋白的N-端脂肽或其它脂類分子，肽脂疫苗以膜錨復(fù)合物形式存在，對光、熱、溶劑性質(zhì)等高度穩(wěn)定，分子量小，易被抗原提呈細(xì)胞（APC)攝�。虎谟捎谥湹挠H脂膜特性，肽脂疫苗可迅速被細(xì)胞攝取或形成微膠粒沉淀，從而不會被血漿/組織中的酶迅速降解；③其代謝產(chǎn)物為無害氨基酸、脂肪酸及可經(jīng)糞、尿排出的代謝中間產(chǎn)物。
（七)細(xì)胞因子
細(xì)胞因子（cytokine)可通過不同環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)和增強(qiáng)DNA疫苗的免疫反應(yīng)。IL-2、IL-12以增強(qiáng)Th1型細(xì)胞免疫為主，GM-CSF以增強(qiáng)體液免疫為主。DNA疫苗中加入細(xì)胞因子基因，對疫苗的免疫應(yīng)答有顯著的影響。若需要使Ｔ細(xì)胞反應(yīng)增強(qiáng)，可選用IL-2基因與DNA免疫原共注射；要制備針對胞外菌的DNA疫苗，可選用IL-4、IL-5、IL-10基因共注射；若需CD4＋Th細(xì)胞、抗體在免疫保護(hù)上均起作用，可共注射GM-CSF和IL-2基因；若Th細(xì)胞、抗體、CTL均需加強(qiáng)，可選用TNF-α基因共注射。
質(zhì)粒載體中插入細(xì)胞因子基因可增加外源基因表達(dá)產(chǎn)物誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。例如，將HBsAg和IL-2基因共表達(dá)或共注射，可使抗體產(chǎn)生和Th細(xì)胞反應(yīng)增加；又如，將編碼IL-6的質(zhì)粒與編碼馬流感病毒血凝素的質(zhì)粒共同注射小鼠，可使小鼠獲得完全保護(hù)。
IL-12是目前發(fā)現(xiàn)對體內(nèi)免疫活性細(xì)胞誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用最強(qiáng)、范圍最廣的細(xì)胞因子，在腫瘤、病毒性疾病及自身免疫性疾病的治療中起主要作用。IL-12可增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效果，在增強(qiáng)特異性外源蛋白免疫應(yīng)答方面具有明確的作用。把IL-12p35和p40基因與HCV C 蛋白或C-E1-E2蛋白重組后，肌肉注射免疫BALB/c小鼠，發(fā)現(xiàn)其脾臟明顯增大，且特異性CTL水平顯著升高，可提高約3倍，但特異性抗體應(yīng)答降低，提示IL-12在加強(qiáng)細(xì)胞免疫的同時(shí)，減弱了體液免疫應(yīng)答，改變了質(zhì)粒DNA的應(yīng)答形式。
（八)免疫刺激復(fù)合物
免疫刺激復(fù)合物（ISCOMs)是以皂角苷QuilA為基礎(chǔ)，通過表面疏水作用，與多個(gè)親水和疏水基團(tuán)的兩性抗原分子及脂質(zhì)分子交聯(lián)，形成直徑約30～40nm的球形籠狀顆粒，類似膜表面抗原構(gòu)造。這樣一方面固化了抗原分子，同時(shí)也較好模擬體內(nèi)識別抗原的微環(huán)境。這種結(jié)構(gòu)變可溶性抗原為顆粒性抗原，加強(qiáng)抗原粘附、吞噬。在體液環(huán)境中增強(qiáng)了與抗原提呈細(xì)胞膜相互作用，其攝入量比同樣大小的顆�？乖哌_(dá)50倍以上，有效地誘導(dǎo)Th克隆增殖、高滴度抗體應(yīng)答和CTL應(yīng)答，發(fā)揮T細(xì)胞免疫佐劑的作用。近年來，臨床上將ISCOMs作為非特異性免疫增強(qiáng)劑，用于抗腫瘤和慢性感染的輔助治療。
疫苗佐劑性與非特異免疫應(yīng)答之間并無明確的界限，新型免疫佐劑研究的主要內(nèi)容之一是探討二者之間最佳的平衡。新型免疫佐劑誘導(dǎo)機(jī)體的非特異性免疫應(yīng)答過強(qiáng)或過度泛化，必然轉(zhuǎn)化成免疫病理過程，出現(xiàn)一系列毒副作用。因此，應(yīng)進(jìn)一步提高新型免疫佐劑作用的靶向性，控制機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和類型，這無疑會具有重要理論意義和實(shí)用價(jià)值。
采用不同理化性質(zhì)的免疫佐劑，通過免疫藥理學(xué)手段，改變免疫途徑和方式，設(shè)計(jì)疫苗及佐劑傳遞系統(tǒng)，采用抗原與佐劑不同的結(jié)合方式，用不同表位抗原等，雖用同樣的抗原，完全有可能激活不同的免疫效應(yīng)細(xì)胞，誘生不同的免疫生物活性分子，產(chǎn)生不同強(qiáng)度（量)和不同類型（質(zhì))的免疫應(yīng)答。
1998年，WHO在“疫苗研究及發(fā)展”報(bào)告中指出，目前微生物疫苗的研制中存在的主要問題是改進(jìn)免疫方法，簡化免疫程序，提高疫苗的穩(wěn)定性及安全性，以及降低疫苗的生產(chǎn)成本。
許多疾病可通過接種疫苗來預(yù)防，目前幾種重要的候選疫苗或有待改進(jìn)的疫苗涉及的病原微生物主要包括：①青少年易感的病原體：如巨細(xì)胞病毒、丙型肝炎病毒、單純皰疹病毒、人乳頭瘤病毒、沙眼衣原體等；②成人易感的病原體：如流感病毒、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、葡萄球菌和幽門螺桿菌等；③地區(qū)流行的病原體：傷寒沙門菌、霍亂弧菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌、麻風(fēng)桿菌、登革病毒、森林腦炎病毒、漢灘病毒、黃熱病毒等。
目前，抗病毒治療仍不盡人意，而疫苗免疫可降低多種急性傳染病的發(fā)病率和病死率，保障兒童健康。WHO在 20世紀(jì)70年代提出了擴(kuò)大免疫規(guī)劃（expandedprogramme on immunization，EPI)，計(jì)劃在1996～2000年＜ 1歲兒童至少 90%以上獲得百白破、脊髓灰質(zhì)炎、結(jié)核、麻疹四苗免疫接種，我國四苗接種覆蓋率縣以上單位已達(dá)到85%以上。WHO將在全世界實(shí)施“全球疫苗與免疫規(guī)劃”（global programme for vaccines and immunization，GPV)，在今后的20年中，各國應(yīng)優(yōu)先發(fā)展破傷風(fēng)、麻疹、乙型肝炎、艾滋病、黃熱病、風(fēng)疹和流感嗜血桿菌疫苗，以及能使6個(gè)月內(nèi)新生兒得到保護(hù)的其它新生兒用疫苗。應(yīng)根據(jù)病毒感染性疾病的流行動態(tài)和發(fā)展情況，研制新的疫苗種類和實(shí)行聯(lián)合免疫，研制同時(shí)激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫的新型疫苗，將疫苗的功效從預(yù)防疾病進(jìn)展到兼有治療作用的治療性疫苗。
預(yù)計(jì)在21世紀(jì)初，經(jīng)過疾病預(yù)防和治療效果的驗(yàn)證，基因疫苗將會走向市場，仍將是疫苗研究熱點(diǎn)。研究的趨勢可能是：尋找延長基因疫苗的活性并使其產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫效應(yīng)的方式，確定最佳的注射方案和劑量，針對特定的病原體從數(shù)千種基因中選擇出最有效的基因制成疫苗，確定基因疫苗在需要時(shí)刺激強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答的措施，尋找出增加整體免疫反應(yīng)，以及使細(xì)胞與體液免疫應(yīng)答關(guān)系最優(yōu)化的途徑。
今后疫苗佐劑發(fā)展的一個(gè)新動向是將抗原定向地傳遞給抗原提呈細(xì)胞，如單核-吞噬細(xì)胞等，以便更好地對抗原進(jìn)行處理和提呈，避免T細(xì)胞耐受產(chǎn)生，極大地增強(qiáng)抗原的免疫原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，特別是細(xì)胞免疫應(yīng)答。人用佐劑是未來研究的重點(diǎn)之一。
總之，疫苗的發(fā)展是一項(xiàng)長期的、需國家政府參與的、高投入、高產(chǎn)出的產(chǎn)業(yè)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展和對各類微生物認(rèn)識的不斷加深，成功預(yù)防及控制各類傳染病和微生物的感染將不再遙遠(yuǎn)。
（陳 元 中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院)
（黃建生 第一軍醫(yī)大學(xué))
