衛(wèi)生毒理學-實驗指導:實驗動物生物標本收集及處死

 1．血液采集  終末和非終末采血技術(如麻醉，取血體積)是有區(qū)別的，在以動物死亡為實驗結(jié)束(終末實驗)時的情況下采血與在清醒動物身上單次或多次采血的情況是迥然不同的。

在實驗過程中減少動物的疼痛與不安和獲得預期實驗結(jié)果一樣重要。這不僅是出于人道主義，而且也是良好科學實踐所要求的內(nèi)容。因某一特定采血技術的動用和由此給動物帶來的不安可能會使動物產(chǎn)生應激，而伴隨應激反應出現(xiàn)的許多生化和生理改變會影響實驗結(jié)果，如血中兒茶酚f1411.cn/yaoshi/胺類、催乳素和糖皮質(zhì)激素的升高會影響葡萄糖、紅細胞數(shù)、白細胞數(shù)和細胞壓積等一些代謝參數(shù)。所以如果不能完全排除應激，那么也應將應激降至最小程度．這不只是為動物考慮，也是為獲得有代表性數(shù)據(jù)的良好科學實驗所需。

在非終末采血中；不要抽血太多，因為取血過多會減少總血量而導致錯誤結(jié)果．總血量的減少會伴隨血紅蛋白含量、氧轉(zhuǎn)運能力和血壓的下降及應激相關激素濃度的升高，也可能進一步產(chǎn)生其他變化，如胃粘膜壞死等。

血液總量取決于物種、性別、年齡、健康及營養(yǎng)狀況。對于同一種物種，較大動物單位體重的總血量比較小的動物要少，老齡和肥胖動物比年輕和正常體重的動物單位體重含總血量少。一般情況下，總循環(huán)血量為55~77mI／kg體重。

非終末采血可分為單次和多次采血，單次采血量低于動物總血量的15%，對動物不會有影響。然而，若取量為總血量的15%～20％，則會出現(xiàn)一些副作用，如心排血量或血壓降低。如果取總血量的30％一40%則會引起缺血性休克，若取血達40％可引起約50％的豬和大鼠死亡。

康的沒有明顯不良反應的動物，單次采血不超過動物總血量的15%，可在3—4周居重復采血。多次采血每24h不應超過總血量的1%[o．6 mi／(kg，d)]，若采集次數(shù)和(或)采血量過多則引起貧血。

對大、小鼠采取不超過o.1ml的毛細管中血液常用尾尖果血法．眼眶靜脈叢穿刺通常適用于無尾動物如倉鼠。當尾靜脈不能滿足較大的采血量時，大/小鼠也可用此技術．一般要求在麻醉下操作。只有當沒有別的方法的特殊情況下，2周后才能考慮用動物恢復的眼眶靜脈叢再次取血。這項技術應由訓練良好的工作人員來操作，而且只能用動物的一只眼睛．不贊成在無麻醉條件下，用眼球摘除法取血。

在毒物動力學研究中，大鼠采血可采用；尾靜脈、趾脈管系、全麻下心臟穿刺、全麻下外頸靜脈和總頸動脈插管。

兔和豚鼠可用耳繞靜脈、頸靜脈或隱靜脈。較大動物的采血可從淺表靜脈進行(隱靜脈、頭靜脈、頸靜脈)。

2．尿液采集  大鼠和小鼠可用代謝籠，下部有糞尿分離鋁。在毒物動力學研究中，對半減期長(數(shù)小時以上)的受試化學物可用代謝籠，對半減期短的受試化學物可在全麻下經(jīng)尿道或經(jīng)腹壁插管至膀胱收集尿液。對犬可用接尿法或?qū)�尿法�?/P>

  3．膽汁采集  在毒物動力學研究中，可直接插管至總膽管，其尖端應接近肝門區(qū)的分叉點．大鼠膽汁一般達0.5－1.0ml。插管后應立即給以受試化學物，因為膽鹽不能再循環(huán)時，膽汁的成分就會改變。對有膽囊的實驗動物(如豚鼠和兔)，應在膽囊基底部結(jié)扎膽囊，以防止膽囊延緩經(jīng)膽汁消除。

4．糞便采集  大鼠和小鼠可用代謝籠，下部有糞尿分離器糞，分析前剃去表層，取內(nèi)層糞分析．

 在麻醉過程中，必須對動物仔細觀測。所用技術設備應可對多個系統(tǒng)進行檢查，如循環(huán)系統(tǒng)(心率、脈搏、血壓”心電圖、外周灌流量、體溫)或呼吸系統(tǒng)(呼吸頻率)。在麻醉程中確定麻醉深度是一個非常重要的步驟。麻醉分為四個時期。

(1)痛覺喪失期(從藥效開始發(fā)揮到意識喪失)。

(2)興奮期t從意識喪失開始出現(xiàn)到規(guī)則呼吸結(jié)束。呼吸不規(guī)則，瞳孔擴大，運動反射增強，眼球震顫，角弓反張．

(3)耐受期，從規(guī)則呼吸開始到自主呼吸結(jié)束。這個時期又分為四段；①規(guī)則呼吸，瞳孔縮小，多數(shù)反射出現(xiàn)；②骨骼肌松弛，瞳孔縮小，眼瞼反射消失，角膜反射出現(xiàn)，呼吸平穩(wěn)，痛覺缺失，是進行手術的最佳麻醉狀態(tài)，③只有角膜反射，呼吸非常困難，瞳孔擴大，④沒有反射，砰吸非常平穩(wěn)，瞳孔擴大。

 (4)窒息期：反射性脯呼吸結(jié)束之后毒劑防止死亡。

應用乙醚時上述各期出瑰較為明顯應用時)，動物的反應會和上述有所不同沒有反射，沒有呼吸，瀕臨死亡，需立即使用解毒劑

進行手術的最佳麻醉狀態(tài)是意識喪失，痛覺喪失和松弛．對不同物種、根據(jù)麻醉的持續(xù)時間，常將短效(30min)、中效(120m[n]、長效(長于120min~,麻醉劑聯(lián)合用藥。

在麻醉時和麻醉后必須檢查動物的體溫，當體溫降低時，要使用加熱燈、加熱墊．在醉終止后動物要經(jīng)歷和麻醉過程相同但順序相反的幾期(耐受期、興奮期、痛覺喪失

常用的麻醉藥物：

(1)短效：對嚙齒類多用乙醚，對大動物可用硫噴妥鈉10～25mg／kg靜脈或腹腔注

 (2)中效，推薦用賽拉嗪+氯胺酮，對嚙齒類5＋100mg／kg肌內(nèi)注射，對大動物2+tag／kg肌內(nèi)注射。

  (3)長效；常用戊巴比妥鈉，對嚙齒類35～50mg／kg腹腔注射，對大動物30mg／kg靜脈或腹腔注射，對大鼠還可用烏拉坦1500rug／k8肌內(nèi)注射．

安死術(euthanama)是指用公眾認可的、以人道主義的方法處死動物的過程，即達到有驚恐或焦慮而安靜地、無痛苦地死亡．安死方法的最重要性的標準是：安死術應具有證動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)立即達到失去痛覺的早期抑制作用．選擇哪種安死術必須根據(jù)待死動物的感覺能力而不是根據(jù)實驗觀察者或操作者的主觀f1411.cn/shouyi/感覺，盡管后者是不容忽視．因此斷頭術或放血致昏法還不失為人道主義的安死術。安樂死的方法對動物的物種年齡應是適宜的，而且應是無痛苦，不引起興奮，能快速導致意識喪失和死亡．此外，方應是可靠、可重復和不可逆的。

建議在實施任何安死術前；對犬、貓及大型動物，都應使用鎮(zhèn)靜劑。如果可能，即將處死的動物不應和其他動物在同一個房間里，特別是當用比較殘忍的方法時，如斷頭法。

安樂死之后，確認動物死亡非常關鍵。死亡癥狀有心跳、呼吸停止，反射缺失。可通過放血或取出心臟，毀損大腦，斷頭，切除內(nèi)臟，出現(xiàn)尸僵等來確保動物死亡。 

毒性病理學檢查是毒理學試驗重要的組成部分，病理學研究有助于確定有害作用和器官。毒性病理學檢查包括大體解剖和組織病理學檢壹兩部分。急性毒性試驗中在試期中死亡或試驗結(jié)束處死的動物都應進行尸體解剖，因為急性毒性試驗的目的是得到有關可能的靶器官以及進行重復染毒試驗劑量設計的信息。在亞慢性、慢性、致癌試驗病理學是一個重要的終點。

1．大體解剖  在實驗動物處死后半小時內(nèi)進行，解剖方法采廚胸腔，腹腔臟聯(lián)合取出法。應觀察有關臟器的外形和表面情況、顏色、邊界和大小、質(zhì)地、切面．對指定自器稱重，并計算臟器系數(shù)。

   2．組織病理學檢查  對指定的器官或組織用鋒利的刀剪取材，應統(tǒng)一取材部位。組織塊一般在10倍體積的10％福爾馬林液中固定，此后常規(guī)制片(組織石蠟包埋、切HE染色)。應詳細記錄顯微鏡下觀察到的病變，并做出病理診斷。必要時，請其他病理學家對有疑問的或有爭論的發(fā)現(xiàn)進行復查．利用特殊染色、組織化學及電子顯微鏡技術可有助于毒作用機制的研究。