。ㄈ)神經細胞的類型
依形態(tài)學分類:Dogiel建議將腸道神經元分為三種類型:
1、I型具有許多短的、不規(guī)則的樹突和一根細而長的軸突。
2、II型有一個短而局限于節(jié) 內軸突和許多長的延伸到神經節(jié) 外的樹突。
3、III型具有中等長短的樹突,終止于同一或鄰近的神經節(jié) 。
Dogiel認為I型屬運動神經元,II型屬感覺神經元。腸道神經節(jié) 內存在dogiel I型和II型細胞,還存在其它的中間型細胞,如在貓的粘膜下神經叢中,單極和雙極的神經細胞占83%,多極的神經細胞占17%。這說明腸道神經細胞形態(tài)的多樣性。然而對于其形態(tài)與功能的相關性,是否I型與II型分別代表感覺及運動神經元,多數學者持懷疑態(tài)度。
依所含化學物質分類:可分為含乙酰膽堿神經細胞、含胺神經細胞、含嘌呤核苷酸神經細胞和含多肽神經細胞。免疫細胞化學技術是顯示含多肽神經細胞的有力工具,F已知在消化管壁內神經叢內含有血管活性腸肽、生長抑素、物質P和腦啡肽等多肽。用雙重免疫染色法可證明一種以上的多肽共存于神經細胞內。
二、消化道全層鋪片技術
用消化道切片結合免疫細胞化學染色固然能顯示壁內神經叢的神經細胞及纖維。但由于壁內神經叢為扁平的網狀結構,欲窺其全貌,則以消化道全層鋪片技術進行免疫細胞化學染色效果最佳。消化道全層鋪片在英文文獻中通常稱為whole mount stretch preparation,即整裝撕片。即根據消化管壁內神經叢的結構特點,分縱層肌、環(huán)層肌、粘膜下層等分層撕開鋪片,以暴露不同的壁內神經叢。以腸道為例,簡述消化道的分層鋪片技術。
動物麻醉后,用Zamboin’s液行主動脈灌注固定,剖腹取任何一段腸管放入上述固定液中4℃下3h,然后移至4%多聚甲醛液固定3h,再移至20%蔗糖4℃過夜,于次日行全層鋪片。選擇一大小適宜的吸管或玻棒穿入腸管,使其被動擴張,然后用鐘表鑷在腸系膜附著處沿腸管縱軸劃痕,用鑷尖沿劃痕輕輕剝離分離縱肌層,將剝離的縱肌層放在載玻片上(漿膜面向下)。在解剖顯微鏡下,用鑷尖輕挑去附于神經叢上的環(huán)層肌,即得縱、環(huán)肌之間的肌間神經叢。再將腸管的粘膜面向外翻套在吸管或玻棒上,用鑷子或手術刀反復刮去表面的上皮層,即可獲固有層表面的粘膜叢,重刮時刮去表面的粘膜層,即可暴露粘膜下層的粘膜下神經叢。
撕片放入0.1mmol/L的PBS溶液中,等待進行免疫染色。其步驟與切片染色同,只是由于撕片較厚,為增強抗體的穿透性,常于染色前在系列酒精中反復脫水后,再進行免疫染色。一般撕片進行免疫染色地漂浮法為佳,可增加壁內神經叢與抗血清的接觸。如撕片數量少,為節(jié)約抗血清也可用載片法,此時載玻片上需涂抹一層粘附劑如鉻礬明膠或多聚賴氨酸,以免撕片在染色過程中脫落。