�。ㄎ�)顯示（Visualization)
顯示又可稱為檢測系統(tǒng)（Detection system)。根據(jù)核酸探針標記物的種類分別進行放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進行不同顯色處理（詳見本章 第二節(jié) )。
細胞或組織的原位雜交切片在顯示后均可進行半定量的測定，如放射自顯影可利用人工或計算機輔助的圖象分析檢測儀（computer – assisted image analysis)檢測銀粒的數(shù)量和分布的差異。非放射性核酸探針雜交的細胞或組織可利用酶檢測系統(tǒng)顯色，然后利用顯微分光光度計或圖像分析儀對不同類型和數(shù)量的核酸的顯色強度進行檢測。但利用ISHH做半定量測定必須注意嚴格控制實驗的同一條件，切片的厚度和核酸的保存量如取材固定的間隔時間等。如為放射自顯影，核乳膠膜的厚度與稀釋度等必須保持一致。
�。�)對照實驗和ISHH結果的判斷
和其它實驗方法一樣，并非ISHH的任何陽性信號都是特異性的，故必須同時有對照試驗以證明其特異性。對照試驗的設置須根據(jù)核酸探針和靶核苷酸的種類和現(xiàn)有的可能條件去選定，常用的對照試驗有下列幾種（表20-1)。
表20-1 ISHH對照試驗一覽表
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核乳膠或非放射性檢測系統(tǒng)對照試驗 |
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Northern 或Southern印跡雜交法* |
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ISHH與免疫細胞化學結合* |
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應用多種不同的核苷酸探針與同一靶核酸進行雜交 |
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將cDNA或cRNA探針進行預雜交（吸收試驗)* |
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與非特異性（載體)序列和不相關探針雜交（置換試驗) |
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將切片應用RNA酶或DNA酶進行預處理后雜交* |
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應用同義RNA探針（Sense probe)進行雜交* |
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以不加核酸探針雜交液進行雜交（空白試驗) |
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組織對照用已知確定為陽性或陰性組織進行ISHH對照 |
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應用未標記探針做ISHH，進行對照 |
從理論上講，對照試驗設置愈多其靶核苷酸特異性確定愈可靠，但現(xiàn)實是不可能的。因此，在上述對照試驗中應任選設至少3～4種用以證實ISHH結果的可靠性。在上述試驗中，標明*者為比較可靠的對照試驗。①Northern 和Southern印跡雜交法證明的方式和用Western印跡法檢測抗體（蛋白質)的特異性一樣，是比較可靠的。②如果具備相當?shù)拿庖呓M化抗血清，可用結合的免疫組織化學和ISHH法從蛋白質（或多肽)水平和轉錄水平在相鄰切片或同一切片中證明同一種多肽和相應mRNA共存于同一細胞中。③預先將切片用DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技術證明丟失的是DNA或RNA。如同免疫組化的吸收試驗一樣，事先與特異性的cRNA或cDNA進行雜交。再進行ISHH，其結果應為陰性。④由于同義RNA探針和組織內(nèi)mRNA序列順序是相同的，應用其進行ISHH，結果應為陰性。檢測系統(tǒng)的對照如乳膠或酶顯色系統(tǒng)也應在無標記探針的情況下進行。
ISHH的最大優(yōu)點是它的高度特異性，它可測定組織、培養(yǎng)的單個細胞或細胞提取物中的核苷酸含量。應用高敏感度的放射性標記cRNA探針在理想的ISHH的實驗條件下檢測mR－NA，其敏感度可達到20個mRNA拷貝/每個細胞。由于雙鏈DNA的穩(wěn)定性，在用ISHH定位DNA時很少發(fā)生丟失，降解。在靶核苷酸序列比較伸展的情況如染色體鋪片，長于2kb的探針可以應用。因此，其敏感性高到能夠出在染色體鋪片上，有時甚至在組織切片上的單個基因拷貝。正因為如此，對ISHH結果的解釋應持慎重態(tài)度，特別是前人未報告過的新發(fā)現(xiàn)。因為如前所述，影響ISHH實驗結果的因素太多，比如在外科或實驗取材后未及時的固定或冷凍可由于組織中mRNA的降解而導致假陰性結果。另外，在各種類型核酸探針進入細胞、組織和各種器官的能力，又叫可接近性（acessiblity)各異。這些諸多因素都將影響ISHH的實驗結果。
